烈冰生物已經(jīng)正式推出了Visium空間轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析服務，（技術(shù)搶先看|全新空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析策略來咯~）為了更好地幫助客戶理解空間轉(zhuǎn)錄組測序，得到完美的組織切片，獲得最優(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，本期開始，小編將為大家詳細介紹空間轉(zhuǎn)錄組測序的原理、樣本制備、實驗流程、案例分析、文章解讀等信息。

其實，空間轉(zhuǎn)錄組的概念早在2016年就已經(jīng)存在了，目前已經(jīng)發(fā)表的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有 Slide-seq、LCM-seq、seqFISH、MERFISH、Liver single cell zonation以及 Tomo-seq。但是這些方法存在操作復雜、檢測精度不準確、基因和細胞檢測量的限制等問題，無法大規(guī)模商業(yè)推廣。

基于Spatial Transcriptomics升級改進后的Visium空間轉(zhuǎn)錄組，是目前唯一一款高精度、高通量的商業(yè)化空間轉(zhuǎn)錄組測序方案，工作流程簡單，從組織切片到文庫構(gòu)建僅需一天，大大節(jié)省時間成本。其本質(zhì)是通過空間條形碼捕獲探針，高通量的原位檢測冷凍組織切片中不同區(qū)域的RNA的表達模式以及空間分布。

當組織冷凍切片附在帶有spatial barcode的空間轉(zhuǎn)錄組載片上時，通過探針上條形碼引物結(jié)合并從組織中捕獲鄰近的mRNA。被捕獲的mRNA開始逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通過上機測序，可以將每個mRNA轉(zhuǎn)錄的序列映射回組織切片中的起始位置。

Visium空間轉(zhuǎn)錄組的核心在于載玻片部分，正式文庫構(gòu)建的載玻片上有4個捕獲區(qū)域（6.5mm X 6.5mm，可以加4個樣本），每個捕獲區(qū)域含有約5000個被條形碼標記的點（barcoded spots），每個spot直徑55μm，spot與spot中心點之間的距離為100μm，每個 spot含有上百萬個可以與mRNA結(jié)合的捕獲探針，每個探針上都帶有獨特的spatial barcodes，用以標記捕獲的mRNA的空間位置。

空間轉(zhuǎn)錄組實驗流程

因為空間轉(zhuǎn)錄組測序是對組織切片進行操作，需要將組織進行切片。因此客戶在制備樣本時，需要將新鮮的組織凍存并進行OCT包埋。 后續(xù)的冷凍切片、RNA 捕獲及文庫構(gòu)建等操作可以視具體情況帶回公司進行實驗。

1、組織凍存

將組織進行凍存的目的是為了得到保護RNA的質(zhì)量及組織形態(tài)的完整，從而真實的反映出細胞和基因在空間中的分布情況。因此，拿到新鮮組織后，需要對組織樣本進行異戊烷速凍。

2、OCT包埋

OCT是一種固形劑，在冰凍切片時可以支撐組織，增加組織的連續(xù)性，減少皺折及碎裂，以保存組織結(jié)構(gòu)完整性。

3、冷凍切片

將質(zhì)檢合格的冷凍組織和10x玻片先放-20℃冷凍切片機箱體中平衡30分鐘以上，再進行切片。

4、文庫構(gòu)建

將組織切片貼合在帶有mRNA結(jié)合捕獲探針的載玻片上，通過甲醛固定、H&E染色并拍照得到組織切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)。再進行透化處理，使細胞中的mRNA釋放，并結(jié)合到芯片相鄰的捕獲探針上。將捕獲的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并構(gòu)建測序文庫進行上機測序，從而獲取基因表達信息。

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總體來說，空間轉(zhuǎn)錄組的實驗流程包括：組織凍存-OCT包埋-冷凍切片-固定染色-組織透化-cDNA合成及建庫-上機測序，而需要客戶進行樣本準備的步驟相對簡單：組織凍存與OCT包埋。

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