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什么是單細胞測序

單細胞測序(single cell sequencing)是指在單個細胞水平上,揭示全基因組范圍內(nèi)的所有基因表達情況,包括鑒定組織細胞類型,反映不同樣本間的細胞異質(zhì)性和組織微環(huán)境,讓您真正了解一塊Bulk組織的每一個細胞的真實狀態(tài)和關(guān)聯(lián),呈現(xiàn)更加真實和全面的細胞世界。 2013年,單細胞測序技術(shù)被《Nature Methods》列為年度技術(shù),同年位居《Science》年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首;2015年再登Science轉(zhuǎn)化醫(yī)學封面,2018年位居《Science》十大科學突破榜首。目前,單細胞測序技術(shù)在腫瘤、發(fā)育生物學、微生物學、神經(jīng)科學、以及植物學等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用,已經(jīng)成為生命科學研究的焦點。

烈冰單細胞測序優(yōu)勢

烈冰單細胞測序為了準確快速地進行單細胞測序研究,基于前沿的研究文獻進行多重優(yōu)化,真正做到準確可靠全面的單細胞測序解析

  • 10X Genomics
  • BD Rhapsody
  • PanoCell
  • BD FACSMelody

10X Genomics單細胞捕獲平臺起源自Drop-Seq技術(shù),通過"雙十字"微流控系統(tǒng)形成一個個含有細胞和凝膠微珠(aelbead)的油包水的乳滴(GFMs),其核心技術(shù)在干凝膠微珠美面的引物序列,由標記細胞的Barcode、標記細胞內(nèi)mRNA的UMI和捕獲mRNA的PolvdT組成。10X Genomics ChromiumTM系統(tǒng)可實現(xiàn)數(shù)千至數(shù)百萬個單細胞的分析,解決常規(guī)scRNA-seq在通量或擴展性方面存在的不足。

BD Rhapsody?單細胞分析系統(tǒng)的誕生基于 BD 在細胞生物學領(lǐng)域 40年的專業(yè)技術(shù), 采用CytoSeq特有的蜂窩板技術(shù)進行單細胞捕獲。該技術(shù)用20W+的微孔(該數(shù)量級遠大于Input細胞數(shù)量),保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了傳統(tǒng)微流控系統(tǒng)中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題,采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率,保證Input細胞的全面使用。

烈冰“智造”PanoCell V2.0版微孔芯片,全面升級外觀、捕獲材質(zhì)、微孔精密程度、細胞落孔率和細胞捕獲效率,提供自研蜂巢板+BD平臺原裝進口單細胞分選試劑+華大T7超高通量測序儀的服務新方案,達到準確穩(wěn)定的單細胞實驗結(jié)果,媲美BD原裝的平臺服務實力,烈冰智造一直不斷努力提高新產(chǎn)品和服務水平,以提供更高效、成本更低的國產(chǎn)化單細胞捕獲方案!

BD FACSMelody?細胞分選儀結(jié)合BD高端分選儀技術(shù)與智能自動化軟件,將簡便易用的分選儀推向一個新高度。便捷的操作可幫助節(jié)約儀器調(diào)試的時間,并且提供質(zhì)量可重復的檢測結(jié)果。BD FACSMelody?細胞分選儀讓更多的研究者可以使用復雜的流式細胞儀和分選技術(shù)獲得更想要的細胞,提高實驗室效率。

樣本要求

樣本類型

組織、血液、培養(yǎng)的細胞系、制備好的單細胞懸液
注:若客戶樣本為組織,且尚未成功將組織樣本消化成單細胞懸液,烈冰將盡可能提供技術(shù)及實驗上的幫助,但因不同類型樣本的特異性,無法保證實驗方法適用于所有類型組織。

質(zhì)量要求

細胞活性大于70%,濃度為500-2000細胞/μl,
體積不小于200μl,細胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+,細胞體積小于40μm。


實驗流程

結(jié)果示例

細胞數(shù)量判斷

采用Fastp軟件對下機原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控,對質(zhì)控后測序數(shù)據(jù)中的cell barcode信息及其對應的counts數(shù)進行統(tǒng)計,判斷測序樣本中實際檢測到的細胞數(shù)量,獲得樣本的測序細胞數(shù),并根據(jù)最終確認的cell barcode信息提取對應的reads。

注:橫坐標為細胞數(shù)量,縱坐標為每個細胞對應的平均counts數(shù),根據(jù)曲線的斜率判斷實際檢測的細胞數(shù)量

基因組比對和表達量統(tǒng)計

以cell barcode對應的reads為研究對象,采用STAR算法將測序數(shù)據(jù)比對到物種對應的基因組上,獲得基因組比對的bam文件。再以bam文件以及基因組注釋文件為研究對象,將比對到同一基因上的UMI進行合并,并去除其中重復的UMI序列,得到每個基因的UMI數(shù)量,統(tǒng)計每個細胞中檢測到的基因數(shù)以及轉(zhuǎn)錄本數(shù)量,并得到表達量矩陣表。

注:左圖為細胞中總共檢測到的基因數(shù)量,右圖為去除重復UMI后統(tǒng)計的基因數(shù)量

細胞過濾和數(shù)據(jù)標化

利用基因組比對結(jié)果以及表達量結(jié)果對測序檢測到的細胞進行過濾,去除細胞中基因檢測數(shù)少、線粒體基因占比大的細胞,統(tǒng)計過濾后的細胞數(shù)量并得到對應的表達量矩陣表。采用數(shù)據(jù)標準化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),對不同樣本中細胞基因表達量進行標準化,得到標準化后的表達量矩陣表。

注:橫坐標表示每個細胞中UMI的數(shù)量,縱坐標表示線粒體基因的占比情況

細胞亞群分析

基于每個細胞中的基因表達量數(shù)據(jù),采用聚類算法對細胞進行亞群分析,同時采用t-SNE分析對細胞的分群結(jié)果進行可視化展示。同時,還可以對不同樣本中各細胞亞群的占比情況進行統(tǒng)計分析。

Chen, et al.Nature?Cell?Biology, ?2021 Jan;23(1):87-98.
注:左圖為前列腺腫瘤組織細胞亞群鑒定t-SNE圖展示;右圖細胞亞群分群情況

Marker基因鑒定

鑒定不同細胞亞群中的Marker基因,并對Marker基因的表達分布進行可視化展示。

Zhang et al., Glia. 2021 Mar;69(3):765-778.
注:?marker基因的Feature Plot圖和Violin圖

差異基因篩選

針對所有或者特定細胞亞群,進行細胞亞群間差異表達基因篩選,獲得細胞亞群間差異表達基因。

Zhang, et al. Glia.?2021 Mar;69(3):765-778.
注:該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類分析Heatmap圖

功能分析(GO Analysis)和信號通路分析(Pathway Analysis)

分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數(shù)據(jù)庫,以及KEGG數(shù)據(jù)庫,對Marker基因/差異基因進行功能分析和信號通路分析,從而得到這些基因群體所顯著性富集的GO條目和Pathway條目。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.
注:該圖為不同cluster之間差異基因顯著富集的GO/Pathway條目

SCENIC分析

基于已知的轉(zhuǎn)錄因子靶點數(shù)據(jù)庫,以及轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的表達矩陣,采用SCENIC算法,對于轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行計算,得到在每一個細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控基因以及調(diào)控強度。

Chen, et al. Nature Communication 2020;?11:5077
注:該圖為不同cluster之間轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控強度heatmap圖

QuSAGE分析

基因集表達激活度定量分析,采用方差膨脹因子(VIF)診斷共線性的方法對于諸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度進行分析,比較不同Cluster所富集的基因集的差異。

Chen, et al.Nature?Cell?Biology, ?2021 Jan;23(1):87-98.
注:該圖為不同cluster之間信號同理調(diào)控強度熱圖

高級數(shù)據(jù)分析

擬時序分析

以細胞的表達量數(shù)據(jù)為研究對象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虛擬時間軸上對細胞的變化模式進行分析,模擬重建細胞的動態(tài)變化過程,獲得細胞間的狀態(tài)轉(zhuǎn)換關(guān)系,以及不同狀態(tài)細胞間差異基因的表達情況。

Chen, et al.Nature?Cell?Biology, ?2021 Jan;23(1):87-98.
注:細胞間狀態(tài)轉(zhuǎn)換的pesudotime軌跡圖(左)、軌跡中細胞占比餅圖(左下) 和?Heatmap圖(右)

細胞通訊分析

以細胞亞群的基因表達量數(shù)據(jù)為研究對象,獲得細胞中的配體及受體基因的表達信息,采用Cellphone DB算法以及數(shù)據(jù)庫,得到細胞亞群間的信號通訊關(guān)系,并計算獲得關(guān)系的顯著性和強度。

Chen, et al. Nature Communication 2020;?11:5077
注:左圖:橫坐標表示細胞類型,縱坐標表示細胞間通訊配受體關(guān)系,圓圈大小表示顯著性差異水平,圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關(guān)系越強

TCGA預后聯(lián)合分析

以TCGA臨床信息以及篩選到的關(guān)鍵基因為研究對象,結(jié)合TCGA臨床數(shù)據(jù),進行預后分析,獲得該基因/基因集與臨床預后之間的關(guān)系。

Zhang C, et al. J Immunother Cancer 2021;9:e002312.
注:橫坐標表示生存期,縱坐標表示占比,不同顏色曲線代表不同分組