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Small RNA Sequencing
Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA（tRF&tiRNA）、snRNA和snoRNA等，是一類不具有蛋白編碼能力的RNA分子，能調(diào)控基因表達，在細胞生長、發(fā)育和代謝等基礎(chǔ)生物學(xué)過程中都扮演著重要的角色，甚至在癌癥等相關(guān)疾病形成過程中也起著關(guān)鍵的作用。高通量測序技術(shù)省去了煩瑣的Small RNA克隆文庫構(gòu)建過程，可以一次性生成上百萬條Small RNA序列，能夠快速鑒定特定條件下表達的已知Small RNA并發(fā)現(xiàn)新的Small RNA，同時還可以研究不同條件下Small RNA的表達差異，并可以聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測序表達譜數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。
A workflow for Small RNA Sequencing
Jai PM et al., RNA Mapping, 2014
1. 針對動物（包括外泌體）Small RNA（miRNA、piRNA、tsRNA）提供定制化實驗分析方案;
2. 不僅能高效準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)并注釋非模式物種新的miRNA，還能進行piRNA、tiRNA、tRF等最新的研究；
3. 及時更新miRBase、miRanda、RNAhybrid等專業(yè)miRNA數(shù)據(jù)庫以及靶基因預(yù)測算法，保證分析結(jié)果緊跟行業(yè)前沿。
組織樣品：
1. 動物組織：>200mg；
2. 植物組織：>200mg；
3. 細胞培養(yǎng)：>2x106個；
4. 全血：>3ml；
5. 菌體：>2x106個或>300mg。
RNA樣品：
1. 請?zhí)峁w積15 μL - 100 μL，總量≥10μg，濃度≥ 200ng/μL的RNA；
2. OD260/280介于1.8~2.2之間，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S:18S≥1.0，確保RNA無降解；
3. 送樣時請標(biāo)記清楚樣品編號，管口使用Parafilm膜密封；
4. 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融；
5. 送樣時請使用干冰運輸。
不同樣品之間存在差異，詳情請向烈冰咨詢
1. 總RNA提取及質(zhì)控：RNA總量 > 1 μg ；RIN> 6.0
2. 小RNA富集：切膠范圍10-50bp
3. 小RNA質(zhì)控：Agilent 2200質(zhì)控
4. 文庫構(gòu)建：文庫分子18-30bp
5. 上機測序：Small RNA測序NovaSeq、HiSeq、Ion Proton等測序儀都可以完成。測序數(shù)據(jù)量40M reads。
>>動物小RNA
堿基質(zhì)量結(jié)果圖（過濾后）
注：橫坐標(biāo)表示堿基位點，縱坐標(biāo)表示堿基質(zhì)量值。
small RNA長度分布情況
注：左圖為miRNA長度分布圖；右圖為piRNA長度分布圖。
small RNA堿基偏好性分析
注：橫坐標(biāo)表示序列長度，縱坐標(biāo)表示百分比，不同顏色表示不同的核苷酸。
miRNAs表達量統(tǒng)計分析
An X et al., Theriogenology, 2016
注：該表格列舉了部分差異miRNAs的名稱和序列信息，NE（normalized expression）表示標(biāo)化后的miRNA表達量。
差異miRNAs熱圖
An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015
注：橫軸表示組別，縱軸表示不同miRNAs。
miRNA靶基因功能和pathway網(wǎng)絡(luò)圖
An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015
注：該圖表示miRNA-204靶向的基因，及其靶基因所顯著富集的GO條目（右）和Pathway條目（左）。
novel miRNAs的莖環(huán)結(jié)構(gòu)
An X et al, Theriogenology. 2016
注：該圖展示了進一步分析與已知miRNA不匹配的測序reads預(yù)測的新的miRNA，這10個序列都具有顯著的莖-環(huán)發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。
miRNAs靶基因網(wǎng)絡(luò)圖
An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015
注： 綠色表示下調(diào)的miRNAs，紅色表示上調(diào)的miRNAs。
DCs分化過程中miRNAs表達情況
Su XP et al., Nature Communications, 2013
注：該圖展示了DCs分化過程中miRNAs表達情況。H、I、M和R分別代表分化的四個階段：H—HSCs；I—imDCs；M—maDCs；R—DCreg，左上角的數(shù)字代表將391個miRNAs分成了26個clusters，左下角的數(shù)字代表每個cluster中miRNAs的數(shù)量，有顏色的clusters代表miRNAs顯著富集。
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