2020年夏天，烈冰正式上線了空間轉(zhuǎn)錄（Visium）組測(cè)序服務(wù)，一年的時(shí)間里，我們后臺(tái)陸續(xù)收到了一些關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的留言，比如之前保存的FFPE組織，能不能拿來(lái)做空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序？聽(tīng)說(shuō)國(guó)內(nèi)空間轉(zhuǎn)錄組現(xiàn)在可以做FFPE樣本了，是真的嗎？

各位看官別急，今天咱就來(lái)嘮嘮，看著風(fēng)很大的Visium FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組到底是什么，和之前的Visium冰凍組織樣本（以下稱visium）區(qū)別在哪？

FFPE即石蠟包埋，是目前絕大多數(shù)科研人員和臨床醫(yī)生首選的長(zhǎng)期保存樣本的方法，該方法可將珍貴樣本保存幾年甚至10年以上，且大多樣本通常有對(duì)應(yīng)的臨床匹配追蹤數(shù)據(jù)，若能結(jié)合高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)疾病研究和治療來(lái)說(shuō)都有非常大的意義。

但因FFPE樣本通常保存時(shí)間長(zhǎng)，組織內(nèi)部可能存在RNA/DNA降解的情況，片段化的RNA用oligoT探針捕獲會(huì)丟失很多信息。而Visium FFPE空間轉(zhuǎn)錄已針對(duì)該問(wèn)題提出了解決方案——不在局限于冰凍組織切片，石蠟樣本也可以獲取基因表達(dá)和空間定位的全部轉(zhuǎn)錄組信息，區(qū)分和定位功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的活躍表達(dá)情況。

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)將組織學(xué)影像與RNA測(cè)序的高通量和發(fā)現(xiàn)能力相結(jié)合，對(duì)樣本進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組（WTA）分析。

Visium冰凍切片技術(shù)是將組織切片固定、透化，釋放細(xì)胞中的RNA直接與帶有RNA捕獲探針的載玻片結(jié)合，獲取基因表達(dá)信息，因其對(duì)polyA尾的探針捕獲設(shè)計(jì)，Visium實(shí)驗(yàn)樣本針對(duì)真核生物，對(duì)物種沒(méi)有明確限制。

在Visium FFPE組織中，樣本切片需先和預(yù)設(shè)的探針（probe）雜交，進(jìn)一步完成連接反應(yīng)，再透化釋放連接probe與載玻片上的探針結(jié)合，從而捕獲基因表達(dá)信息。Visium FFPE目前針對(duì)人（1.8萬(wàn)個(gè)gene）和小鼠（2萬(wàn)個(gè)gene)的基因數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)了探針，用RNA模板連接（RTL），特異地針對(duì)編碼蛋白轉(zhuǎn)錄組中基因的探針對(duì)與其基因靶點(diǎn)雜交，然后彼此連接。對(duì)組織進(jìn)行透化處理，以釋放連接的探針對(duì)，使其與玻片上的捕獲探針雜交，從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)信息的捕獲。

具體來(lái)說(shuō)，針對(duì)FFPE樣本RNA降解的特殊性，Visium FFPE針對(duì)每一個(gè)基因（人和小鼠），都預(yù)先設(shè)計(jì)了一對(duì)probe以靶定RNA的特定序列，LHS（左端探針）帶有read2序列，用以后續(xù)PCR擴(kuò)增，RHS（右端探針）帶有polyA序列，用以后續(xù)被玻片探針捕獲結(jié)合，通過(guò)probe與組織內(nèi)RNA雜交，將RNA信息轉(zhuǎn)移到probe上，再將探針兩端連接形成完整的DNA鏈。之后降解雜合RNA鏈，透化釋放連接probe，完成信息捕獲過(guò)程。

而在玻片探針設(shè)計(jì)方面，Visium FFPE也延續(xù)了Visium的強(qiáng)大實(shí)力，每個(gè)捕獲區(qū)域大小為6.5mm X 6.5mm，含有4992個(gè)被條形碼標(biāo)記的點(diǎn)（barcoded spots），每個(gè)spot直徑55μm，spot與spot中心點(diǎn)之間的距離為100μm，每個(gè)spot含有上億個(gè)可以與mRNA結(jié)合的捕獲探針，每個(gè)探針上都帶有獨(dú)特的spatial barcodes，用以標(biāo)記捕獲的mRNA的空間位置。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，Visium FFPE技術(shù)是對(duì)FFPE組織進(jìn)行切片，并將其放置在文庫(kù)制備玻片上，然后進(jìn)行固定，通過(guò)H&E或免疫熒光（IF）染色并成像，接著添加空間條形碼并構(gòu)建文庫(kù)。對(duì)制備好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，獲得后續(xù)數(shù)據(jù)分析的原始數(shù)據(jù)。

看到這是不是對(duì)Visium FFPE有初步了解了呢？下期小編將進(jìn)一步為大家介紹Visium FFPE的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，敬請(qǐng)期待~