在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析專題前兩期的講解中，小編已經(jīng)為大家介紹了數(shù)據(jù)的質(zhì)控、標(biāo)準(zhǔn)化和聚類，以及細(xì)胞類型的鑒定，不知道大家是否還記得這個(gè)細(xì)胞類型鑒定的圖呢？

鑒定好細(xì)胞類型后，我們還可以對(duì)其進(jìn)行一些功能性分析，如擬時(shí)序分析和SCENIC分析，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)意義進(jìn)行一定程度上的挖掘。本期小編主要為大家介紹擬時(shí)序分析（Pseudotime Analysis）。

1、Q & A環(huán)節(jié)

Q1：我們?yōu)槭裁匆M(jìn)行擬時(shí)序分析？？

l 機(jī)體為響應(yīng)各種應(yīng)激，其細(xì)胞會(huì)從一種功能“狀態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N功能“狀態(tài)”；

l 當(dāng)細(xì)胞在不同狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變時(shí)，往往會(huì)經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄重組，導(dǎo)致一些基因被沉默，一些基因被重新激活，但純化這些瞬態(tài)細(xì)胞進(jìn)行研究是很困難或不可能的；

l ScRNA-seq擬時(shí)序分析可以讓我們?cè)诓恍枰兓那闆r下查看這些細(xì)胞狀態(tài)。

Q2：ScRNA-seq擬時(shí)序分析是什么？？

擬時(shí)序分析，即根據(jù)不同細(xì)胞亞群基因表達(dá)量隨時(shí)間的變化情況，構(gòu)建細(xì)胞譜系發(fā)育，但這里的時(shí)間并不是真時(shí)間，而是一個(gè)虛擬的時(shí)間，是指的細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化和演替的順序和軌跡。

l 即使在同一個(gè)樣本中，也會(huì)存在多種不同的細(xì)胞形態(tài)。因此，不論測(cè)定了多少樣本，我們都可以采用擬時(shí)序分析對(duì)樣本中的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和變化進(jìn)行描述。

Q3：擬時(shí)序分析用的工具是啥？它能進(jìn)行哪些分析？

l Monocle是用于ScRNA-seq擬時(shí)序分析的經(jīng)典工具（R包），目前已更新至3版本；

l Monocle是使用算法來學(xué)習(xí)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中每個(gè)細(xì)胞必須經(jīng)歷的基因表達(dá)變化序列，一旦了解了基因表達(dá)變化的整體“軌跡”，Monocle就可以將每個(gè)細(xì)胞放置在軌跡中的適當(dāng)位置。

l 我們可以使用Monocle中的相關(guān)分析工具做Beam分析（Branch Expression Analysis Modeling），揭示重要的基因和細(xì)胞。

（算法參考文獻(xiàn)：Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories.）

2、烈冰擬時(shí)序分析工作流搭建

3、擬時(shí)序分析結(jié)果解讀

對(duì)于擬時(shí)序分析來說，研究某一特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)化，如M1/M2型巨噬細(xì)胞極化、CD8⁺ T細(xì)胞激活和耗竭等等，往往具有一定的生物學(xué)意義。這里小編通過對(duì)上期T細(xì)胞進(jìn)行亞群鑒定，以CD8⁺ T細(xì)胞亞型為例進(jìn)行擬時(shí)序分析（圖1）。

圖1 CD8⁺ T細(xì)胞亞群鑒定流程

（1）CD8⁺ T細(xì)胞樹形結(jié)構(gòu)軌跡

圖2 CD8⁺ T細(xì)胞樹形結(jié)構(gòu)軌跡

圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，具有相似狀態(tài)的細(xì)胞被聚到一起，每個(gè)分支點(diǎn)代表一個(gè)可能的細(xì)胞生物學(xué)過程決策點(diǎn)（該例圖中只有1個(gè)分支點(diǎn)）。圖2展示了CD8⁺ T細(xì)胞每個(gè)cluster在偽時(shí)間軸上的分布，不同顏色代表不同cluster。我們這邊通過對(duì)每個(gè)cluster進(jìn)行細(xì)胞類型鑒定，初步將cluster 2/3/6鑒定為記憶T細(xì)胞，cluster 7鑒定為Na?ve T細(xì)胞。

（2）CD8⁺ T細(xì)胞所處分化時(shí)間軌跡

Monocle基于離默認(rèn)偽時(shí)間軸起點(diǎn)的遠(yuǎn)近，將細(xì)胞排布如圖3所示。在該圖中顏色越深代表默認(rèn)的起點(diǎn)，顏色越淺表示離偽時(shí)間軸起點(diǎn)越遠(yuǎn)。注意：這邊的起點(diǎn)是monocle算法計(jì)算出來的，而非實(shí)際真正的起點(diǎn)。

圖3 CD8⁺ T細(xì)胞所處分化時(shí)間的軌跡圖

以該例圖為例，我們結(jié)合每個(gè)分支（共3個(gè)分支）中的cluster類群是否高表達(dá)CD8⁺ Na?ve T細(xì)胞相關(guān)Marker（如LEF1、SELL和CCR7等）, 耗竭性T細(xì)胞相關(guān)Marker（如LAG3、HAVCR2、CD27、TIGIT等），以及細(xì)胞增殖相關(guān)Marker（如MKI67、TOP2A、CCNB1等），將起始狀態(tài)鑒定為Na?ve T細(xì)胞，終末狀態(tài)為耗竭性（Cell fate 1）和增殖型（Cell fate 2）T細(xì)胞。

（3）Beam分析

確定了分化起點(diǎn)后，Monocle可以模擬出每個(gè)細(xì)胞所處的分化時(shí)間，并尋找隨著分化時(shí)間逐漸升高或降低的基因表達(dá)熱圖和分布圖，即Beam分析。圖4將Top200差異基因聚成4類，展示了pre-branch向cell fate1和cell fate2狀態(tài)分化相關(guān)的命運(yùn)決定基因。圖5展示了與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，如MKI67和TOP2A在cluster 5中高表達(dá)，提示cluster 5作為CD8⁺ Na?ve T細(xì)胞終末分化狀態(tài)是一種增殖型細(xì)胞（Proliferating）。除此之外，如果有特別關(guān)注的基因也可以基于關(guān)注的基因進(jìn)行繪制。

圖4 擬時(shí)序Beam分析基因表達(dá)熱圖

圖5 擬時(shí)序Beam分析基因表達(dá)分布圖

總的來說，通過對(duì)CD8+T細(xì)胞亞型進(jìn)行擬時(shí)序分析得到了CD8+ T細(xì)胞的分化軌跡，進(jìn)行Beam分析可以幫助得到與狀態(tài)分化相關(guān)的命運(yùn)決定基因。以上，就是本期單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析——擬時(shí)序分析的全部?jī)?nèi)容，敬請(qǐng)期待下期SCENIC分析的精彩內(nèi)容～