半月板在關(guān)節(jié)穩(wěn)定、減震、接觸力分布和關(guān)節(jié)潤(rùn)滑等方面起著重要作用，其包含不同的細(xì)胞類型，主要包括軟骨細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞和纖維細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞。然而，半月板的細(xì)胞類型組成、分布和相應(yīng)的生物標(biāo)志物，以及治療半月板退變的生物靶點(diǎn)仍不清楚。

2019年12月7日，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院廖威明教授課題組和張志奇教授課題組通過(guò)ScRNA-Seq詳細(xì)描繪半月板的細(xì)胞組成，鑒定出一種在半月板組織工程中具有應(yīng)用前景的祖細(xì)胞，并證明了半月板的退變機(jī)制。并且通過(guò)TGFβ1治療有效緩解半月板退變提出一種半月板退變的潛在治療策略。此次研究工作中的單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)與數(shù)據(jù)分析由烈冰科技參與支持。該研究成果以“Single- cell RNA- seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration”為題發(fā)表于《Annals of the Rheumatic Diseases》（IF=14.299）期刊。

分析思路：

測(cè)序樣本信息：

健康半月板樣本、退變半月板樣本

測(cè)序平臺(tái)：

BD Rhapsody系統(tǒng)

測(cè)序數(shù)據(jù)量：

100G

研究結(jié)果：

1. ScRNA-Seq揭示健康人半月板的細(xì)胞組成類型

研究者首先對(duì)健康人的半月板組織進(jìn)行ScRNA-Seq，對(duì)3639個(gè)細(xì)胞進(jìn)行t-SNE分析，共分出7個(gè)亞群，其中包含兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞亞群：

①    內(nèi)皮細(xì)胞(EC)；②軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞 (CPC)；③調(diào)節(jié)性軟骨細(xì)胞(RegC)；④纖維軟骨細(xì)胞（FC)；⑤預(yù)肥大軟骨細(xì)胞(PreHTC)；⑥纖維軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞(FCP)；⑦增殖纖維軟骨細(xì)胞(ProFC)。并進(jìn)一步通過(guò)免疫組化來(lái)確定各細(xì)胞亞群的分布，F(xiàn)CP主要分布于半月板表面，RegC在半月板中部，EC存在于紅區(qū)血管周圍 ，而PreHTC分布于白區(qū)。

圖1 健康人半月板的單細(xì)胞圖譜

2.健康人半月板細(xì)胞的分化軌跡分析

研究者通過(guò)擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)FCP和EC存在于分化軌跡的起始處。為了進(jìn)一步探究FCP是否具有祖細(xì)胞的性質(zhì)，根據(jù)高表達(dá)基因分選出CD146+原代半月板細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行分化和克隆能力的驗(yàn)證。通過(guò)集落形成和多向分化潛能分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD146+細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化并形成集落。提示在健康人半月板細(xì)胞中，FCP具有祖細(xì)胞的特性。

圖2 人半月板祖細(xì)胞的鑒定

為了研究FCP的分化軌跡，研究者選取了FCP、ProFC、FC、PreHTC和RegC重新構(gòu)建了一條新的分化軌跡（圖3A）。軌跡起始部位由FCP和ProFC組成，其后為PreHTC，而末端Fate 1為FC，末端Fate 2由RegC組成（圖3B）。進(jìn)一步分析FCP向 Fate1和Fate2分化過(guò)程中各亞群細(xì)胞基因表達(dá)模式（圖3C、3D）。

為了確定細(xì)胞分化軌跡，研究者分析了各亞群細(xì)胞的差異表達(dá)基因及表達(dá)模式，并研究了體內(nèi)半月板發(fā)育過(guò)程，觀察1、2、3、4、8、26和52周小鼠半月板中marker基因的表達(dá)情況（圖3E）：COL1A1出生后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在4周時(shí)達(dá)到高峰，隨后表達(dá)量逐漸降低；MYLK在3周后，表達(dá)量顯著下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基因表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序分析得出的趨勢(shì)相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了FCP的分化軌跡。

圖3 FCP分化的單細(xì)胞軌跡分支點(diǎn)分析

3.健康人群半月板與退變半月板單細(xì)胞圖譜的對(duì)比分析

研究者首先通過(guò)觀察組織結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)退變半月板的膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂（圖4A）。然后對(duì)健康和退變半月板進(jìn)行ScRNA-Seq分析（圖4B-E），發(fā)現(xiàn)退變半月板的各細(xì)胞亞群占比發(fā)生顯著變化，并發(fā)現(xiàn)三個(gè)新的亞群：(1)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(MoDC)；(2)肥大軟骨細(xì)胞(HTC)；(3)退變半月板祖細(xì)胞(DegP)。

圖4 健康人半月板與退變半月板單細(xì)胞圖譜的對(duì)比分析

4. 單細(xì)胞分化軌跡提示DegP是半月板退變的關(guān)鍵因素

研究者通過(guò)集落形成和多向分化潛能分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DegP（CD318+細(xì)胞）可以形成集落并向多種細(xì)胞分化，證明在退變半月板中，DegP具有祖細(xì)胞特性。因此，研究者重新選取FCP、ProFC、CPC和DegP四個(gè)亞群來(lái)構(gòu)建分化軌跡，軌跡起始端主要由FCP和ProFC組成，F(xiàn)ate 1和Fate 2分別由DegP和CPC組成（圖5A、5B）。

通過(guò)比對(duì)健康與退變半月板的命運(yùn)分支點(diǎn)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在半月板的退變過(guò)程中，F(xiàn)CP向DegP的分化是異常的細(xì)胞狀態(tài)（圖5C、5D）。研究者對(duì)此采用免疫組化染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)DegP標(biāo)記基因（GAS1、DNER）在半月板病變且細(xì)胞增殖的區(qū)域顯著高表達(dá)(圖5E)。

此外，研究者還利用IL-1β分別刺激健康和退變半月板細(xì)胞，得到相似的結(jié)果：CD146+細(xì)胞減少和CD318+細(xì)胞增加，提示促炎介質(zhì)IL-1β誘導(dǎo)DegP活化是半月板退變的機(jī)制。

圖5 單細(xì)胞分化軌跡提示DegP是半月板退變的關(guān)鍵因素

5. TGFβ信號(hào)通路的激活可以抑制退變半月板CD318+細(xì)胞的增加

由于TGFβ信號(hào)通路激活后會(huì)增強(qiáng)半月板干細(xì)胞的分化能力。研究者觀察到在健康半月板細(xì)胞中TGFβ信號(hào)通路被上調(diào)，而且其配體TGFβ1顯著高表達(dá)（圖6A-D）。因此，研究者利用TGFβ1體外刺激退變半月板細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD318+細(xì)胞數(shù)量明顯減少、COL1A1（FCP標(biāo)記基因）表達(dá)量增加（圖6E、6F），提示TGFβ可能有延緩半月板退變的作用。

圖6 TGFβ信號(hào)通路的激活可以抑制退變半月板Cd318+細(xì)胞的增加

綜上所述，研究者通過(guò)使用ScRNA-Seq全面描繪了健康及退變半月板細(xì)胞的圖譜，并確定了在半月板組織工程中具有重要意義的CD146+祖細(xì)胞。其次，研究者還證實(shí)了促炎介質(zhì)誘導(dǎo)DegP活化是半月板退變的可能機(jī)制，TGFβ可以減少DegP的比例，這可能成為延緩半月板退變的治療策略。

原文鏈接：

http://dx.doi.org/10.1136/annrheumdis-2019-215926