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單細胞測序困難重重,烈冰關(guān)鍵技術(shù)——細胞消化懸浮方案

時間:2018-07-20    |    閱讀量:10528

前方高能!單細胞測序?qū)嶒炄藛T請迅速集合!迅速集合!

上回說到,走在生命科學(xué)研究前沿的急先鋒們,已經(jīng)了解了單細胞測序在各自研究方向上的應(yīng)用與價值,正摩拳擦掌準(zhǔn)備大干一番,卻遇到了重重障礙。今天,我們就來聊一聊單細胞測序第一個“攔路虎”----單細胞消化與懸液制備,以及實驗過程中潛在的那些“坑”。

目前,單細胞測序的主要應(yīng)用領(lǐng)域為人類醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、遺傳生殖、干細胞等研究領(lǐng)域,涉及到的主要樣品類型十分廣泛,但根據(jù)其來源,可分為如下幾個大類:1)腫瘤組織,如肝癌、胃癌、乳腺癌等;2)實體組織來源的原代分離細胞,如腦神經(jīng)元、腸道組織來源的上皮及干性細胞等;3)血液來源的某些細胞亞群(一般可以通過不同biomarker進行FACS分選),如通過5色標(biāo)記的造血干細胞群體;4)干細胞誘導(dǎo)分化/重編程相關(guān)的細胞樣品。

如何根據(jù)自己課題的方案設(shè)計及樣品類型,選擇合適的單細胞制備方法,是事關(guān)成敗的第一要素?。ㄉ欧治龅耐瑢W(xué)先冷靜一下,沒說你們不重要,畢竟好的樣品通過好的測序技術(shù)得到好的RAW DATA才能發(fā)揮你們的生信優(yōu)勢對不?。?/span>CNS文章里的方法學(xué),寫的都很(bu)經(jīng) (xi) 典(zhi),看了之后還是一頭霧水。質(zhì)量濃度單位還是活性濃度單位?That is a question.

因此烈冰的實驗團隊決定自己動手做一批動物實驗,摸索并優(yōu)化出一套更適用的單細胞懸液制備方案。

l 實驗?zāi)康模罕容^不同類型膠原酶消化針對不同類型組織的消化效果,摸索出適用于小鼠不同組織器官(如心、肝、脾、肺、腎和腦)的消化條件。

l 實驗材料:剪刀、鑷子等器械需提前滅菌處理,RPMI-1640,FBS,D-Hanks`緩沖液(也可以換成含有Ca2+HBBS)。膠原酶I/II/IV/V(具體類型及對應(yīng)貨號如下圖)。

l 實驗方法:以肝臟、心臟為例,進行演示,詳細流程及注釋事項如下圖所示。

注釋事項:

① 解剖小鼠,取其具體靶器官時,一般采取斷頸的方式,優(yōu)勢是處理快速、方法通用,但會引起體內(nèi)局部(尤其是胸腔)內(nèi)凝血,對心臟、主動脈和肺等組織有一定影響;解剖過程,務(wù)必快速準(zhǔn)確,盡量減少細胞活性的損失;

沖洗過程,一般采用預(yù)冷的生理鹽水/PBS/D-Hanks`/RPMI-1640等液體。此步驟注意兩點:預(yù)冷+維持細胞活性的“液體”。一般情況下,建議RPMI-1640添加FBS10%終體積(其實就是完全培養(yǎng)液)。也有老師用終濃度1-5%的BSA,其實作用都是為了提高細胞懸液制備過程中的細胞活性。

剪碎過程,注意兩點:快速+越小越碎越好??梢詼?zhǔn)備一次性的平皿,提前注入5-10 ml預(yù)冷的完全培養(yǎng)液,在預(yù)冷環(huán)境中剪碎組織。

④ 膠原酶消化,這一步注意事項較多。首先,明確適用于該組織的膠原酶,詳細情況見上面表格;一般情況下,IV型最通用,但特殊類型的組織用單一類型的酶效果更好;另外,根據(jù)研究目的,如果樣品所處微環(huán)境組織類型復(fù)雜,可以配成混合型的膠原酶,如II+IV型;第二,使用終濃度,我們整理了20+的CNS文章,發(fā)現(xiàn)有作者用質(zhì)量濃度mg/ml,也有的用活性單位濃度UI/ml,考慮到各公司貨品單位質(zhì)量對應(yīng)的活性不同,建議以活性單位濃度UI/ml為基準(zhǔn)。大多數(shù)的IIIV型膠原酶的使用濃度為100-200 UI/ml。最后,注意消化時間。一般情況下,膠原酶在37℃條件下活性最強,消化時間為20-30 min;也有文章在處理腫瘤組織時,消化4 h甚至過夜。不敢多想,深表懷疑。另外,也有老師喜歡用4℃消化過夜的方式,細胞數(shù)量和活性也都還不錯,可以嘗試,但可能不會通用于所有類型的組織。

⑤ 終止酶的消化,一般來說都是加入血清的。但是,由于膠原酶本身不受血清影響,因此,只能采用離心—棄上清—加培養(yǎng)液重懸的“素質(zhì)三連”來洗去殘留的膠原酶。至于細胞碎片,這一步基本上都是通過低轉(zhuǎn)速短時間離心的方式進行的,基本上300 g,5 min即可。既保證活細胞離心收集,又保證細胞碎片懸浮在上清中被棄掉。如果,老式離心機只能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速(rpm),沒有g(shù)這一選項的話,一般情況下是1000-1500 rpm。

⑥ 紅細胞裂解,這一步其實很糾結(jié)。先說結(jié)論,該裂還是要裂的,不過盡量在初步分離細胞的時候把紅細胞去除干凈。不過,像心臟和肝臟這樣的組織,本身紅細胞含量就超級高,裂紅在所難免。至于為什么糾結(jié),因為有些細胞類型被裂紅試劑處理后,會發(fā)生聚集并收縮在一團,用移液器輕微的吹打不容易將其分開,會影響后續(xù)實驗的單細胞得率。

最終,在檢測細胞活性/數(shù)量的時候,再啰嗦幾句。以本人十幾年的實驗經(jīng)驗(暴露年齡了),要么走經(jīng)典路線,光學(xué)顯微鏡+細胞計數(shù)板+臺盼藍;要么走高科技路線,活/死細胞熒光染料染色后全自動計數(shù)儀操作。這里不建議用臺盼藍染色,再全自動計數(shù)的儀器,貴不貴不是最重要的,關(guān)鍵是不準(zhǔn)確,且批次間可重復(fù)性太低,低到你崩潰。明明鏡下觀察活性相當(dāng)客觀,為何全自動說細胞都掛了呢,不思其解。問了周圍的小伙伴,以及銷售器材的一些朋友,確實也有不少人碰到過這一情況。

最后,給大家提一些單細胞懸液制備的注意事項:

1) 針對具體組織類型選對酶,以及使用濃度;多種類型組織共存,可配置混合型酶反應(yīng)液;提前摸索活性濃度;

2) 酶干粉配置母液時要含有Ca2+離子才能激活活性;

3) 需要預(yù)冷的,需要室溫的,或者需要37℃的,都提前準(zhǔn)備好。一般情況下,酶消化用37℃,其他分離過程用4℃減少活性損失(包括離心);

4) 組織剪的越小,分離效果越好;

5) 離心機最好是帶g的,300 g+5 min通用全程;不帶g的話,1000-1500rpm即可,轉(zhuǎn)速過高,細胞活性會受影響,碎片也越多。

6)說了這么多,希望對大家的實驗有幫助。如果還有其他實驗技術(shù)疑問,可以關(guān)注我們的微信公眾號(烈冰生物),烈冰還會陸續(xù)分享更多關(guān)于單細胞測序的實驗技術(shù)和數(shù)據(jù)分析技巧。


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