前幾天，小編向大家分享了單細(xì)胞TCR測序技術(shù)在阿爾茲海默氏疾病（Alzheimer disease, AD）中的研究，今天烈小冰將為大家?guī)韱渭?xì)胞核測序技術(shù)（Single-nucleus RNA sequence, snRNA-Seq）在AD中的相關(guān)研究。

一、 單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（snRNA-Seq）

隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（scRNA-Seq）的蓬勃發(fā)展，其在在胚胎發(fā)育，腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性，免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化等多方面屢建奇功，但是由于細(xì)胞形態(tài)的不同和單細(xì)胞制備中細(xì)胞敏感性的差異等因素影響，scRNA-Seq在數(shù)據(jù)分析時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞類型占比失真，個(gè)別細(xì)胞類型丟失等情況。為了克服單細(xì)胞測序技術(shù)的局限性，單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（snRNA-Seq）應(yīng)運(yùn)而生，snRNA-Seq可利用凍存組織直接制備單細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，不僅克服了細(xì)胞形態(tài)差異致使的細(xì)胞捕獲差異，還克服了單細(xì)胞測序必須使用新鮮樣本的多個(gè)局限性。

snRNA-Seq已被廣泛的用于神經(jīng)科學(xué)研究，隨著鼠腦、猴腦、以及人腦細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜的不斷完善，加速推進(jìn)著人類攻克神經(jīng)疾病的步伐。下面就讓我們用一篇文獻(xiàn)走進(jìn)神經(jīng)疾病研究，了解單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)吧。

二、snRNA-Seq在阿爾茲海默氏疾病中的研究

2020年1月，nature medicine 在線發(fā)表了美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Marco Colonna 和 Maxim N. Artyomov團(tuán)隊(duì)的共同研究成果“Human and mouse single-nucleus transcriptomics reveal TREM2-dependent and -independent cellular responses in Alzheimer’s disease ”

阿爾茨海默病(AD)是一種具有復(fù)雜病理生物學(xué)特征的異質(zhì)性疾病，大部分病例發(fā)生在65歲之后，構(gòu)成遲發(fā)性癡呆（late-onset AD）。在病理水平上，AD的起因是因?yàn)?a name="undefined">β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的胞外積累，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的聚集和過度磷酸化，最終導(dǎo)致神經(jīng)突觸功能障礙和細(xì)胞的死亡。本研究利用snRNA-Seq，深入探討了小膠質(zhì)（Microglia）在AD中的變化，以及小鼠和人在AD病程中膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的差異變化。

三、 分析思路

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序：

樣本信息：

鼠腦樣本：5×FAD、Trem2^-/- 5×FAD、Trem2^-/-、WT四種7月齡和15月齡小鼠模型皮質(zhì)/海馬，每組各三只

人腦樣本：AD患病的TREM2-CV（11例）和TREM2-R62H（10例），以及正常人（11例）腦的背外側(cè)前額葉皮質(zhì)

技術(shù)平臺(tái): 10×Genomics系統(tǒng)，Illumina HiSeq 4000/6000

四、主要研究成果

（一）通過snRNA-Seq描述β-淀粉樣蛋白和Trem2對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

研究者為探究小鼠對AD病程的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)，以及β-淀粉樣蛋白和小膠質(zhì)在AD病程中的變化，首先對7月齡的5×FAD小鼠、Trem2敲除的5×FAD小鼠、Trem2敲除小鼠、以及野生型小鼠模型進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序，總共分析了73419個(gè)細(xì)胞核。結(jié)果表明阿爾茲海默癥5×FAD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他小鼠模型（圖1 e-f），同時(shí)研究者們通過對15月齡小鼠模型的分析，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移5×FAD與Trem2敲除后的5×FAD小鼠模型間小膠質(zhì)細(xì)胞差異不再明顯。這說明β-淀粉樣蛋白（Aβ）對小膠質(zhì)的影響部分依賴于Trem2受體。

圖1  5×FAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞增殖性

（二）疾病相關(guān)小膠質(zhì)（DAM）轉(zhuǎn)錄變化依賴于Trem2受體

前人的研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞不僅響應(yīng)AD，同時(shí)還參與AD病程的調(diào)節(jié)。所以研究者們將小膠質(zhì)細(xì)胞作為關(guān)注重點(diǎn)，分析了不同樣本、不同年齡段、和不同細(xì)胞類型間的差異基因（DEGs）（圖2）。發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)分類群在不同樣本間有明顯差異（圖2 e-f），在5×FAD小鼠模型中，疾病相關(guān)小膠質(zhì)(Disease-associated microglia, DAM)明顯增多，DAM相關(guān)的Cst7，Csf1，Apoe，Trem2，Lpl，Lilrb4a，H2-d1，Cd74和許多組織蛋白酶基因在5×FAD小鼠中也顯著上調(diào)，而小膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)基因P2ry12，Selplg，Tmem119和Cx3cr1則被下調(diào)（圖2 b-d）。進(jìn)一步比較Trem2突變體中的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，5×FAD中DAM相關(guān)基因的表達(dá)量也較突變體小鼠高，這更加肯定了Trem2（Triggering receptor expressed on myeloid cells 2）在AD病程反應(yīng)中的重要性，小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化一定程度上受Trem2的影響。

圖2  5×FAD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平特性

三、少突膠質(zhì)細(xì)胞的響應(yīng)體現(xiàn)出Aβ依賴性

為深入了解AD病程對大腦細(xì)胞的影響，研究者們將關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)移至除小膠質(zhì)細(xì)胞外的其他細(xì)胞類型，同樣利用差異基因篩選的方法，研究了不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)5×FAD小鼠與WT小鼠相比，少突膠質(zhì)細(xì)胞中的C4b，Serpina3a，和H2-d1基因顯著上調(diào)，且這些基因在7月齡小鼠（圖3 a）中的表達(dá)顯著高于15月齡小鼠（圖3 b）。同時(shí)通過不同樣本的比較（圖3 c）分析，說明了少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化也可能受到Aβ和Trem2的影響，繼而利用免疫熒光驗(yàn)證了這一猜想（圖3 d-i）。

圖3 在AD病程中少突膠質(zhì)細(xì)胞的變化

綜合單細(xì)胞核測序結(jié)果和免疫熒光結(jié)果，說明在疾病的早期階段，Aβ在小鼠體內(nèi)的積累與少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、活性狀態(tài)是平行關(guān)系，可能是部分依賴Trem2。與此同時(shí)，少突膠質(zhì)細(xì)胞C4b和Serpina3n的分泌，可能促進(jìn)Aβ的聚集。

從snRNA-Seq數(shù)據(jù)中可以看出，相比于小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，Aβ的聚集對其他細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄水平的影響并不明顯（圖4）。

圖4 AD對其他細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄水平的影響

（二）四、AD患者的腦與小鼠模型具有明顯的差異性

為更準(zhǔn)確的反映AD病程對人腦的影響，研究者們繼續(xù)利用snRNA-Seq技術(shù)分析了TREM2-CV，TREM2-R62H，和Controls 三種人腦樣本共66311個(gè)細(xì)胞核。與正常人腦相比，AD患者的腦細(xì)胞中NEFL⁺ NEFM⁺的神經(jīng)細(xì)胞（Ex1）明顯減少，這與前人研究AD病患神經(jīng)元細(xì)胞丟失的結(jié)果相一致（圖5）。

同樣在人腦中進(jìn)行差異基因分析發(fā)現(xiàn)，許多神經(jīng)元基因下調(diào)，與小鼠模型相比，穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因TMEM119，P2RY12，CX3CR1反而在AD患者的腦中上調(diào)表達(dá)。并且IRF8作為差異基因也在AD病患的腦中上調(diào)。這一特征不禁讓人聯(lián)想到周圍神經(jīng)損傷（PNI）小鼠模型，IRF8驅(qū)動(dòng)的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平變化與其非常相似（圖5 c-j）。

圖5 snRNA-Seq構(gòu)建AD人腦轉(zhuǎn)錄圖譜

（五）AD擾亂星形膠質(zhì)與神經(jīng)元的代謝協(xié)調(diào)性

比較AD患者和正常腦的基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)髓鞘形成相關(guān)基因（STMN4，SEMA3B，MIR219A2）在少突膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，而CA2，SLC38A2，MID1IP1等基因卻上調(diào)表達(dá)，這樣的表達(dá)模式與AD病程致使的神經(jīng)元軸突退化表型具有一致性。另一方面，5×FAD小鼠模型少突膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的Serpina3n和C4b，在人腦中其同源基因SERPINA3和C4B卻是在星形膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)（圖6）。這一發(fā)現(xiàn)從側(cè)面反映出人腦和鼠腦在進(jìn)化過程中的差異性。利用NanoString基因表達(dá)分析，檢測到小膠質(zhì)細(xì)中IRF8基因和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的CA2基因在AD樣本中均上調(diào)表達(dá)，與snRNA-Seq結(jié)果相吻合。同時(shí)對代謝通路的分析也反映出AD病程會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞衰退，認(rèn)知能力下降的AD病理特征。

圖6  snRNA-Seq和NanoString基因表達(dá)分析解析AD人腦膠質(zhì)細(xì)胞變化

（六）AD人腦中TREM2對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

無論是前人研究還是本文小鼠模型的探究，不斷說明著小膠質(zhì)細(xì)胞在AD病程中的重要性，并且本文還利用小鼠模型證明了Trem2受體在小膠質(zhì)響應(yīng)AD病程中的關(guān)鍵性。最后研究者們?yōu)榱颂接慣REM2在人的AD病程是否也具有相似的作用，對TREM2-CV、TREM2-R26H和TREM2-R47H樣品進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞對AD的響應(yīng)在三個(gè)樣品中存在差異，TREM2-R26H和TREM2-R47H的表型反應(yīng)不如正常人腦，證實(shí)了小鼠模型中的結(jié)論，小膠質(zhì)細(xì)胞在AD病程中的響應(yīng)過程是依賴于TREM2受體的（圖7）。

圖7  R62H和R47H突變型降低了小膠質(zhì)細(xì)胞對AD的響應(yīng)

總的來說，本文研究者主要利用snRNA-Seq技術(shù)，先后在小鼠模型和人中證明了小膠質(zhì)細(xì)胞在AD病程中的重要性，同時(shí)通過人和鼠的比較，發(fā)現(xiàn)了AD病程在人和鼠之間存在一定的差異性。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41591-019-0695-9（DOI: 10.1038/s41591-019-0695-9）

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