在高通量測序領(lǐng)域,流傳著一句話,叫做“Junk in, junk out.”,這就意味著要想得到一個好的數(shù)據(jù)分析結(jié)果,就需要對前期的每一步操作都進行嚴格的把關(guān),包括樣本的制備、測序以及數(shù)據(jù)的前期處理等。在整個單細胞測序?qū)嶒炦^程中,前期樣本的選取以及單細胞懸液的制備是整個實驗成敗的第一步。當(dāng)獲得單細胞懸液之后,如何精準(zhǔn)的判斷細胞的質(zhì)量、監(jiān)控單個細胞的分選效果則顯得更為重要,因為這一步直接關(guān)系著最后測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量以及數(shù)據(jù)分析結(jié)果的好壞。因此就需要對整個實驗流程進行嚴格的質(zhì)控和記錄。
NovelBio使用的單細胞分選系統(tǒng)(BD Rhapsody)可以對實驗過程中從單細胞懸液質(zhì)量評估到Single Cell分選標(biāo)記的每一個步驟進行質(zhì)控及記錄,包括單細胞懸液中細胞數(shù)量、活性的檢測,單細胞分選標(biāo)記過程中細胞、磁珠的鋪板情況、細胞被磁珠捕獲標(biāo)記的情況以及雙細胞的比例等,在獲取實驗過程中關(guān)鍵信息的同時,也有效保證了實驗結(jié)果的可靠性。
圖1 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)
1、 單細胞懸液質(zhì)量評估
細胞數(shù)量、細胞活性的精準(zhǔn)判斷對Single Cell分選標(biāo)記、建庫、下機數(shù)據(jù)的質(zhì)量都具有著決定性的作用。如若細胞計數(shù)偏高,將會影響建庫的成功率;計數(shù)偏低,則會顯著提高雙細胞的比例;而細胞活率過低,就會使測序數(shù)據(jù)的利用率大打折扣,因此把好單細胞懸液質(zhì)量這一關(guān)尤為重要。
BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)集成了熒光顯微成像系統(tǒng),可以對不同熒光標(biāo)記的細胞進行檢測并計數(shù)。在進行質(zhì)量評估之前,首先要將細胞的培養(yǎng)體系更換成上機所需的Buffer。在這個過程中,需要進行多次離心、重懸操作,Novelbio單細胞實驗團隊推薦采用水平轉(zhuǎn)子離心機來進行這步操作(下圖左)。這種離心機可以有效減少細胞在多次更換Buffer過程中的損失,尤其是對于細胞量較少的樣本來說,顯得非常有必要。更換完Buffer之后,還需要將細胞進行過篩操作,去除較大的細胞團,獲得較為純凈的單細胞懸液。
圖2 單細胞重懸、過篩操作
在更換完Buffer之后在實驗中,可以通過Calcein AM和Draq7對細胞進行染色,兩種染料分別標(biāo)記單細胞懸液中的活細胞以及死細胞,37℃避光孵育后(下圖左上),將細胞懸液加入血球計數(shù)板(下圖左下),載入BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)中進行熒光顯微成像(下圖右),對細胞的狀態(tài)進行評估。
圖3 細胞染色并上機檢測
當(dāng)BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)對染色后的細胞進行掃描并照相后,根據(jù)明場及熒光成像結(jié)果,可以對單細胞懸液中的細胞數(shù)量、活細胞比例進行計算,進而對單細胞懸液的質(zhì)量進行評估。結(jié)果如下圖所示,其中左上、右上、左下分別為同一視野下的明場、綠色熒光、紅色熒光結(jié)果,右下為數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,計算并獲得了細胞總數(shù)及活細胞比例。
圖4 細胞計數(shù)及活性檢測結(jié)果
2、 細胞鋪板
當(dāng)單細胞懸液滿足鋪板要求后,就可以進行單細胞分選標(biāo)記操作了,在這一步,主要用到的儀器和耗材有如下幾種,分別為BD Rhapsody單細胞分選儀(下圖左上),BD Cartridge單細胞分選蜂巢板(下圖右上),BD Rhapsody 電動移液器(下圖左下)。
圖5 BD Rhapsody單細胞鋪板設(shè)備及耗材
在單細胞的鋪板過程中,由于不同操作人員手法具有不可避免的差異,不同的液體流速將直接影響單細胞的入孔效果。因此BD Rhapsody分選平臺還專門配套了定制的電動移液器,其具有Prime Treat、Cell Load、Bead Load、Wash、Lysis、Retrieval多種操作模式,來對應(yīng)各種不同的操作。通過已經(jīng)設(shè)定的程序來控制液體的流速,大幅度降低人為操作習(xí)慣帶來的差異,保證實驗操作的一致性。
圖6 BD Rhapsody單細胞分選定制電動移液器
根據(jù)已有的細胞計數(shù)結(jié)果,將單細胞懸液稀釋到合適的鋪板濃度后,就可以進行鋪板操作了。待細胞因重力落入蜂巢孔內(nèi)后,可以通過BD Rhapsody成像系統(tǒng)對細胞的真實入孔情況進行檢測,根據(jù)圖像結(jié)果可以清楚看到每個孔內(nèi)是否有細胞落入以及落入多少個細胞,統(tǒng)計并評估實際的鋪板效果。(下圖)。
圖7 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)細胞鋪板情況檢測
3、 磁珠鋪板及清洗
待細胞鋪板完成后,就需要往BD Cartridge蜂巢板中加入過量磁珠,來保證大部分孔內(nèi)都能夠落入磁珠(下圖左),隨后再用Buffer清洗去除多余的磁珠(下圖右)。整個過程同樣可以通過BD Rhapsody成像系統(tǒng)進行掃描,評估磁珠的實際鋪板情況,并統(tǒng)計分析得到細胞和磁珠落入同一孔內(nèi)的數(shù)量,獲得細胞的真實捕獲情況。
圖8 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)磁珠鋪板情況檢測
4、 細胞裂解及磁珠收集
當(dāng)蜂巢孔內(nèi)同時落入細胞和磁珠后,接下去可以往BD Cartridge板中加入細胞裂解液對細胞進行裂解,使細胞內(nèi)的RNA與磁珠上的標(biāo)簽進行結(jié)合,完成每個細胞內(nèi)RNA的捕獲和標(biāo)記。這時,再將捕獲了RNA的磁珠進行回收,待所有質(zhì)控結(jié)果確認通過后就可以進行后續(xù)的RNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA第二鏈合成等實驗操作。而BD Cartridge板則需要再進行一次成像,獲得磁珠收集后的掃描圖,判斷磁珠是否已經(jīng)被有效收集。
圖9 BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)磁珠收集后檢測圖
5、 實驗總結(jié)報告
根據(jù)每一步的質(zhì)控結(jié)果,烈冰科技(NovelBio)單細胞實驗團隊會根據(jù)單細胞分選的實驗結(jié)果生成實驗總結(jié)報告,判斷每一步驟是否通過質(zhì)控,并得到最終捕獲的單細胞數(shù)量以及雙細胞比例,對整個實驗進行總結(jié)評估。若所有過程通過質(zhì)控,實驗樣本即可進行下一步實驗操作。
圖10 實驗總結(jié)報告
6、 烈冰團隊助力單細胞研究
單細胞測序技術(shù)(Single Cell Sequencing)從一種新興的研究角度,借助已有的高通量測序手段,幫助研究者在腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、發(fā)育學(xué)、免疫學(xué)以及其他領(lǐng)域中進行單細胞層面的數(shù)據(jù)解析,解決了Bulk Population Sequencing所無法解決的問題。這樣一個新的研究領(lǐng)域必然也需要足夠可靠的實驗手段來支撐。BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng)為此提供了完善的硬件設(shè)備,保證了從單細胞懸液質(zhì)量評估到單細胞分選標(biāo)記過程中每一個實驗步驟的精準(zhǔn)質(zhì)控。NovelBio單細胞實驗團隊借助BD Rhapsody單細胞分選系統(tǒng),在實驗實施層面對單細胞測序結(jié)果的可靠性提供了強有力的保證。繼單細胞懸液制備之后,又在另一道關(guān)鍵關(guān)卡提供了可靠的支持,幫助研究者在單細胞測序領(lǐng)域收獲更多的成果。