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生命體是個錯綜復雜的網(wǎng)絡(luò)，任何一類RNA分子都不是獨立存在的，越來越多的研究團隊發(fā)現(xiàn)長RNA可以通過“miRNA 海綿”機制結(jié)合和吸附部分互補的miRNA，從而間接調(diào)控miRNA靶基因的表達。
CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物一種抵御外來入侵核酸的免疫系統(tǒng)，已被廣泛用于遺傳育種、新藥開發(fā)、疾病治療、動物模型構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及分子診斷等各領(lǐng)域的基因組編輯中，被譽為在后基因組時代開創(chuàng)了遺傳疾病精準治療的新時代。
烈冰生物合作伙伴——海軍軍醫(yī)大學王越教授團隊、上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院秦興軍/王業(yè)飛合作團隊與美國南加州大學應其龍團隊合作在《Molecular Cancer》雜志（IF=41.444）上發(fā)表Cas9 RNA新機制解析和新應用開發(fā)的研究成果。
基于基因編輯技術(shù)和RNA-seq，團隊發(fā)現(xiàn)了外源性長鏈核酸物質(zhì)Cas9 RNA可通過miRNA海綿機制影響宿主細胞基因表達，并開發(fā)了RNA序列優(yōu)化策略，以提高該基因編輯系統(tǒng)的安全性。烈冰生物提供了研究中的RNA測序和部分生物信息數(shù)據(jù)分析支持。
結(jié)果解析
Cas9 RNA通過 miRNA 海綿機制影響宿主細胞基因表達
為了分析 Cas9 對其預測的結(jié)合microRNA及其靶基因的調(diào)節(jié)作用，團隊從331個細胞系中導入Cas9的細胞的轉(zhuǎn)錄特征數(shù)據(jù)庫中提取了各基因的RNA表達數(shù)據(jù)及其對應的親本對照數(shù)據(jù)，使用 miRanda 軟件分析相應Cas9 RNA與所有已知的人類 miRNA 之間的結(jié)合可能性：其中結(jié)合可能性最高的51個miRNAs被命名“Cas9-miRNAs”，而69個不與Cas9結(jié)合的miRNAs被命名為“non-Cas9-miRNAs”。
在這331個細胞系中，研究者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)“Cas9-miRNAs”的靶基因在很多細胞中存在Cas9 RNA導入后上調(diào)宿主細胞中相應miRNA的靶基因表達的趨勢；而“non-Cas9-miRNAs”的靶基因就不存在這種趨勢，這符合Cas9 RNA通過 miRNA 海綿機制發(fā)揮作用的假設(shè)。其中Let-7家族是Cas9 RNA的主要調(diào)節(jié) miRNA（186種細胞在引入Cas9后，let-7i的相關(guān)靶基因普遍上調(diào)表達），此外qPCR和Western Blot實驗也證實，在更多類型的細胞（U251、786-O、T98G 與 MCF7）在引入 Cas9 后，一些let-7i的靶基因顯著上調(diào)。因此，Cas9 RNA可能充當了 microRNA 海綿，進而影響 Cas9-miRNA靶基因。
那么為什么 Cas9 的 miRNA 海綿效應在不同的細胞系中差異很大呢？
基于miRNA基礎(chǔ)表達數(shù)據(jù)庫（CCLE）和331個細胞系數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析后，團隊發(fā)現(xiàn)let-7i相關(guān)Cas9敏感細胞的let-7i靶基因表達水平較低，而let-7靶基因的高頻突變都分布在“Cas9不敏感”細胞中，即靶基因的表達量和突變等可能影響了Cas9 RNA發(fā)揮miRNA海綿效應。
優(yōu)化 Cas9 RNA 序列可降低其對細胞增殖和let-7靶基因的影響
基于大多數(shù) let-7下游靶基因是癌基因，而Cas9可以調(diào)節(jié)部分 let-7靶基因的表達，團隊通過Cas9病毒載體/對照的細胞培養(yǎng)（例如人前列腺癌細胞系DU145）和體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)Cas9可輕度促進細胞增殖和細胞集落形成及腫瘤細胞的生長。因此有必要優(yōu)化Cas9 RNA來提高該技術(shù)的安全性。
為了進一步驗證miRNA海綿機制及在RNA水平上優(yōu)化Cas9序列，研究人員構(gòu)建了一個同義突變質(zhì)粒（Cas9-Mut），發(fā)現(xiàn)Cas9-mut的mRNA可以被翻譯成與Cas9相同的氨基酸序列。HEK293細胞的RNA-pulldown實驗顯示，相較于Cas9組，Cas9-mut與let-7的結(jié)合顯著減少，轉(zhuǎn)染 Cas9-Mut的DU145細胞的增殖能力和let-7靶基因上調(diào)能力也弱于轉(zhuǎn)染Cas9的細胞，這給未來可以通過同義突變的方法進一步優(yōu)化Cas9 RNA提供了可能。
為了確定優(yōu)化后的Cas9-Mut是否仍然具有基因編輯功能，團隊將Cas9-Mut和設(shè)計的 EGFP-gRNA引入穩(wěn)定表達EGFP的HEK293細胞后，出現(xiàn)了一些EGFP陰性細胞；Cas9-Mu質(zhì)粒和靶向UBXN4基因的gRNA轉(zhuǎn)入DU145細胞也證實Cas9-Mut仍然具有基因編輯功能，這為其在實際應用中提供了支持。
海軍軍醫(yī)大學王越、上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院秦興軍/王業(yè)飛，美國南加州大學的應其龍為論文的共同通訊作者，海軍軍醫(yī)大學的蔣俊鋒，曾韜，張莉和范杏飛為文章的并列第一作者。?
原文鏈接:https://doi.org/10.1186/s12943-022-01604-x