癌癥的特征之一是逃避免疫系統(tǒng)殺傷，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中一種常見的內(nèi)源性修飾。研究表明，m6A甲基化在逃避免疫系統(tǒng)破壞中具有重要功能。YTHDF1是一種多功能、強大的m6A reader，近年來在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的作用逐漸成為研究熱點，但YTHDF1對免疫逃逸的影響還知之甚少。

近日，烈冰合作伙伴上海質(zhì)子重離子醫(yī)院孔琳教授團隊在Nature Communications（IF=17.694）上發(fā)表了題為“Tumor-intrinsic YTHDF1 drives immune evasion and resistance to immune checkpoint inhibitors via promoting MHC-I degradation”的論著。該研究通過單細胞測序技術(shù)（scRNA-seq）揭示了腫瘤固有的YTHDF1驅(qū)動免疫逃逸和免疫檢查點抑制劑（ICI）抵抗，YTHDF1缺失促使免疫系統(tǒng)恢復(fù)監(jiān)測。

烈冰生物承擔了本研究中的單細胞測序和數(shù)據(jù)分析工作，下面跟隨小編的步伐，一起來看看本文的實驗設(shè)計和研究成果吧~

實驗設(shè)計

單細胞實驗分組：Ythdf1-KO腫瘤（n = 3），WT腫瘤（n = 3）

主要技術(shù)手段：CRISPR/Cas9基因編輯、轉(zhuǎn)錄組測序、單細胞測序、TMT蛋白質(zhì)組、免疫組化、免疫熒光檢驗法、免疫沉淀（eCLIP）、Western blot等

捕獲細胞數(shù)：29325個CD45⁺免疫細胞

單細胞捕獲平臺：烈冰生物10x Genomics平臺

單細胞分析工具應(yīng)用：烈冰生物NovelBrain^®云平臺：細胞聚類、GO分析、Pathway分析、擬時序分析等

研究結(jié)果解析

01 YTHDF1與ICI耐藥性相關(guān)

基于TCGA-皮膚黑色素瘤（SKCM）數(shù)據(jù)集進行免疫評分，作者發(fā)現(xiàn)在m6A調(diào)控因子中，YTHDF1 RNA與免疫評分呈顯著負相關(guān)，提示其可能在調(diào)節(jié)免疫逃逸中發(fā)揮作用。單樣本基因集富集分析表明，腫瘤固有YTHDF1呈現(xiàn)“免疫荒漠”表型。此外，對ICI治療具有耐藥性的黑色素瘤B16/F10細胞系中，YTHDF1表達顯著上調(diào)。通過分析現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，YTHDF1的高表達與ICI治療的耐藥性有關(guān)，與其他m6A reader相比，YTHDF1發(fā)揮了更重要的作用。

圖1 YTHDF1與“免疫荒漠”表型和ICI耐藥性相關(guān)

圖2 YTHDF1缺失抑制正常小鼠的腫瘤生成

03 Ythdf1-KO和WT小鼠腫瘤的免疫景觀

       為了進一步揭示免疫微環(huán)境的異質(zhì)性，作者進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（Ythdf1-KO和WT腫瘤浸潤CD45⁺免疫細胞），獲得了22個細胞亞群并進一步劃分為10種免疫細胞群體。其中T細胞、NK細胞和增殖混合免疫細胞在Ythdf1-KO腫瘤中富集，而中性粒細胞和B細胞在WT腫瘤中浸潤程度更高。細胞類型和占比在KO組和WT組之間表現(xiàn)出明顯的差異。

圖3 Ythdf1-KO和WT小鼠腫瘤的免疫微環(huán)境

       深入研究發(fā)現(xiàn)，在CD4⁺ T細胞進一步可細分為naive CD4⁺ T細胞、effector memory CD4⁺ T細胞（CD4⁺ TEMs）、regulatory CD4⁺ T細胞（Tregs）、proliferating CD4⁺ T細胞和IFN-responsive CD4⁺ T細胞。其中KO組中naive CD4⁺ T細胞只占6%，而CD4⁺ TEMs，Tregs等相較于WT組明顯增加。KEGG和GO富集結(jié)果均顯示，一系列免疫相關(guān)通路（如：抗原加工和呈遞、T細胞受體信號通路等）在CD4⁺ TEMs、proliferating CD4⁺ T細胞中上調(diào)。綜上，KO組中proliferating CD4⁺ T細胞和CD4⁺ TEMs亞型的免疫功能強于WT組。

圖4 CD4⁺ T細胞分析結(jié)果

        CD8⁺ T細胞可進一步細分為4種T細胞亞型，其中KO組腫瘤表現(xiàn)出更多的CD8⁺ T細胞浸潤。體外細胞毒性實驗顯示，KO組腫瘤浸潤CD8⁺ T細胞比WT組具有更強的體外殺傷能力。而大量中性粒細胞（特別是腫瘤相關(guān)中性粒細胞）多浸潤在WT腫瘤中。如上結(jié)果說明腫瘤固有YTHDF1缺失促進了抗腫瘤免疫細胞的浸潤，并通過重新構(gòu)建TME來減少促腫瘤免疫細胞。

圖5 CD8⁺ T細胞分析結(jié)果

04 YTHDF1缺失增強了ICI治療效果

       通過比較WT組和KO組之間的免疫檢查點分子發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中，YTHDF1缺失會增加PD-L1蛋白在體內(nèi)的表達，而抗PD-L1或抗CTLA-4抗體治療可以顯著減小Ythdf1-KO組的腫瘤體積。其中87.5%的抗CTLA-4和75%抗PD-L1治療的小鼠表現(xiàn)出了腫瘤完全排斥并實現(xiàn)無瘤生存。YTHDF1缺失將冷腫瘤轉(zhuǎn)化為熱腫瘤，其與ICI協(xié)同治療顯著延長總生存期；攜帶Ythdf1-KO細胞、并被ICI治愈的小鼠可以抵抗WT腫瘤的再次攻擊，這表明這種聯(lián)合療法可以引發(fā)有效、持久的免疫記憶，避免腫瘤復(fù)發(fā)。

圖6 YTHDF1缺失會增強ICI治療效果

       結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，YTHDF1缺失抑制了溶酶體基因的翻譯過程，并限制了MHC-I和抗原的溶酶體蛋白水解，最終增強了免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別能力，恢復(fù)腫瘤免疫監(jiān)測。

圖7 YTHDF1促進MHC-I水解

圖8 外泌體介導(dǎo)的YTHDF1缺失通過恢復(fù)體內(nèi)抗腫瘤免疫來延緩腫瘤生成

全文總結(jié)

綜上，本研究闡明了腫瘤固有YTHDF1在驅(qū)動免疫逃逸中的作用及其潛在機制。YTHDF1缺失可增強CD8⁺和CD4⁺ T細胞的浸潤來改變TME的組成，同時也會限制MHC-I和抗原的水解，最終恢復(fù)腫瘤免疫監(jiān)測，并引發(fā)了強大的抗腫瘤免疫。此外，該研究開發(fā)了一種外泌體誘導(dǎo)的CRISPR/Cas9傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)可消耗YTHDF1并恢復(fù)腫瘤免疫監(jiān)測，為抑制和治療腫瘤細胞提供新的研究思路。

圖9 YTHDF1驅(qū)動免疫逃逸的機制

上海質(zhì)子重離子醫(yī)院孔琳教授為本文的通訊作者，上海質(zhì)子重離子醫(yī)院林萬尊為本文第一作者。

本研究詳細信息參見原文鏈接：10.1038/s41467-022-35710-7