眾所周知，科研人的每一步都是在刀尖上舞蹈，任何一個成功的protocol背后，或許都有無數(shù)個“爆肝”的夜晚和經(jīng)驗累積，尤其是針對植物單細胞領(lǐng)域，大家都還在“摸著石頭過河”的階段，上期植物領(lǐng)域干貨分享，我們聊到了植物組織單細胞測序的現(xiàn)狀和技術(shù)壁壘（詳情戳這里），大多數(shù)研究是先獲取原生質(zhì)體后再行捕獲單細胞進而測序，但原生質(zhì)體的制備過程較為復(fù)雜，制備方法的專一性較強，在不同物種間難以直接遷移制備過程，甚至可能存在“彼之蜜糖，汝之砒霜”的效果。

因此這段時間，小編廣羅各大科學(xué)網(wǎng)站，挖到幾篇基于細胞核制備的植物單細胞測序的文章，獨樂樂不如眾樂樂，本篇先和大家介紹一種能夠從楊樹單個細胞核而不是整個細胞中表征mRNA的方法，幫助大家減少因制備原生質(zhì)體而帶來的問題。

實驗材料：

楊樹梢尖（Populus tremula × alba INRA clone 717 1B4）和楊樹莖（nisquly -1），兩種材料均具有不同程度的細胞復(fù)雜性和細胞壁結(jié)構(gòu)。
10牛血清白蛋白封閉液、RNase 抑制劑、鹽酸精胺、亞精胺、DTT、4X 細胞核分離緩沖液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12mM MgCl₂, 10 mM EDTA, 1M sucrose）、細胞核分離洗脫緩沖液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 1M sucrose）
鑷子、無菌刀片、玻璃平板、移液槍、40uM濾網(wǎng)、5ml帶帽試管、50ml離心管、1.5ml RNase-free低吸附管
低溫離心機、 恒溫搖床、細胞分選儀等

詳細實驗步驟解析

制核效果驗證

如上操作方法盡量減少了葉綠體等細胞器的污染和可能堵塞微流控芯片的細胞碎片，從制核結(jié)果來看，研究者獲得了40000個DAPI+核（總回收體積67-70μl），可用于后續(xù)單細胞核測序?qū)嶒灐?/span>

基于10x Genomics平臺的細胞核捕獲及數(shù)據(jù)分析結(jié)果，測序數(shù)據(jù)基本飽和的情況下，Mean Reads per Nucleus在43000左右，mapping率＞73%，楊樹莖組織的2個重復(fù)顯示了表達基因之間的高度共性。

楊樹組織細胞核制備注意事項

1、 細胞核分離開始前，需將實驗中所用的所有溶液、無菌刀片、各個規(guī)格的離心管、移液管等所需工具放置于0-4℃預(yù)冷至少30分鐘，并在實驗過程中保持低溫狀態(tài)（置于冰上）。
2、 整個實驗過程需在冷室低溫環(huán)境下操作，以減少RNA降解。
3、 整個實驗過程從植物材料收集到最終的分選，應(yīng)在90分鐘內(nèi)完成，以減少RNA污染和降解。
4、 制作組織勻漿時，應(yīng)保證所有植物材料必須與含有RNA降解抑制劑的緩沖液接觸。由于在樣品制備的這一階段可能會發(fā)生RNA降解，因此可以事后進行RNA提取和質(zhì)量評估以驗證其完整性。
5、 離心、洗脫、轉(zhuǎn)移勻漿等步驟操作均在冰上進行。
參考文獻
A robust method of nuclei isolation for singlecell RNA sequencing of solid tissues from the plant genus Populus. PLoS One 2021 May 11;16(5):e0251149