近日，《基因組蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)報(bào)》（Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 簡稱GPB）公布了2022年度“中國生物信息學(xué)十大進(jìn)展”，針對肝臟腫瘤免疫微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞的大隊(duì)列研究成果《Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity》上榜。

值得注意的是，該研究采用124例肝癌患者病例的160個(gè)樣本，8只小鼠的29個(gè)新鮮組織樣本，基于Drop-seq技術(shù)（10x Genomics平臺)進(jìn)行了大隊(duì)列中性粒細(xì)胞在肝癌的免疫微環(huán)境亞型的異質(zhì)性研究。

這與我們大家探討過的基于單細(xì)胞測序技術(shù)如何有效捕獲中性粒細(xì)胞的問題不謀而合，雖然Drop-seq技術(shù)對中性粒細(xì)胞的捕獲提出了更高的要求，但如此大規(guī)模的應(yīng)用該技術(shù)對中性粒細(xì)胞的研究，或許可以給大家一些參考。

01.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        團(tuán)隊(duì)采用肝癌患者160個(gè)樣本(124個(gè)病例），29個(gè)新鮮組織（8只小鼠），通過無抗體富集進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。此外，對84個(gè)配套病例進(jìn)行了外顯子測序并收集了8個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集、453個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和10個(gè)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行了數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析。

        單細(xì)胞捕獲技術(shù)：Drop-seq

        單細(xì)胞捕獲平臺：10x Genomics

        單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析工具：細(xì)胞聚類分析，subCluster分析，差異基因表達(dá)分析，GO/Pathway分析，基因集富集分析，公共數(shù)據(jù)（單細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組）聯(lián)合分析等

        主要技術(shù)手段：scRNA-seq、多色免疫熒光、ATAC-seq、外顯子測序等

02.分離中性粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

        中性粒細(xì)胞是一類“嬌滴滴”的細(xì)胞，通常在體內(nèi)進(jìn)入外周血后存活不超過一周，體外存活不超過24小時(shí)。脆弱細(xì)胞更需要溫和的呵護(hù)，且先前的肝癌單細(xì)胞研究中均未報(bào)道過中性粒細(xì)胞的存在。

        本研究中，團(tuán)隊(duì)也強(qiáng)調(diào)了中性粒細(xì)胞獲取的特殊性。針對樣本前處理環(huán)節(jié)，研究團(tuán)隊(duì)對組織樣本保持最小的操作時(shí)間，僅采用MACS死細(xì)胞去除處理細(xì)胞懸液，將樣本前處理時(shí)間從手術(shù)后縮短（腫瘤和鄰近肝組織）到2h內(nèi)（包括PCR反轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)過程），延長處理時(shí)間可能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞捕獲失敗。

數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)，中性粒細(xì)胞UMI檢測范圍設(shè)置為100-6000，其他細(xì)胞群的UMI檢測范圍保持在500-6000，最終在基因CSF3R、S100A8和S100A9表達(dá)的基礎(chǔ)上，共鑒定出34307個(gè)中性粒細(xì)胞。

03.主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果解析

基于生信數(shù)據(jù)分析，團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)解析出89個(gè)細(xì)胞亞群，包括11個(gè)首次發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞亞群，基于聚類分析，獲得了5種不同的免疫微環(huán)境亞型，包括免疫激活型；髓系富集免疫抑制型；基質(zhì)富集免疫抑制型；免疫排斥型和免疫駐留型。

        11個(gè)中性粒細(xì)胞亞群中，團(tuán)隊(duì)成功鑒定出6群腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞，分別富集在外周血、癌旁和腫瘤組織中。其中兩個(gè)中性粒細(xì)胞亞群CCL4+ TAN和PD-L1+ TAN可能促進(jìn)了腫瘤的生長?；诩?xì)胞共培養(yǎng)、轉(zhuǎn)錄組測序、ATAC-seq和多色免疫熒光等實(shí)驗(yàn)，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CCL4+ TAN招募腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞僅為促進(jìn)腫瘤生長，而PD-L1+ TAN抑制了CD8+ T細(xì)胞的殺傷能力。

基于小鼠肝癌自發(fā)腫瘤模型，團(tuán)隊(duì)利用Anti-Ly6G抗體進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)小鼠中性粒細(xì)胞去除后有效遏制了肝癌的生長，其骨髓、外周血、癌旁和腫瘤組織的中性粒細(xì)胞亞群的開始發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，中性粒細(xì)胞有望成為肝癌免疫治療的新靶點(diǎn)。

04.烈冰PanoCell^®單細(xì)胞服務(wù)方案有效應(yīng)對中性粒細(xì)胞的單細(xì)胞測序研究

        結(jié)合烈冰既往測序服務(wù)經(jīng)驗(yàn)和該文章發(fā)表情況，基于Cyto-seq的微孔捕獲技術(shù)依靠細(xì)胞在微孔中的重力沉降作用，捕獲過程比較溫和，無需其他通電加壓等強(qiáng)刺激操作，對此類敏感脆弱的細(xì)胞損傷可能較小，對實(shí)驗(yàn)前處理操作要求的包容性也相對更高，更適合此類特殊項(xiàng)目的研究。烈冰自主研發(fā)PanoCell蜂巢板，采用微孔捕獲細(xì)胞技術(shù)，可有效獲得中性粒細(xì)胞。

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