清明假期馬上就要到了，小伙伴們有沒有做好出游計劃呢~

我們都知道，清明節(jié)是中華民族數(shù)千年以來的重大春祭節(jié)日，掃墓祭祀，緬懷祖先。在這樣一個尋根問祖的最好時節(jié)，作為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)者，烈小冰也同大家一起在細(xì)胞層面追溯一下生物個體的起源，也算是應(yīng)時應(yīng)景。

今天烈小冰為大家介紹的文章由上海交通大學(xué)Bio-X實(shí)驗(yàn)室于2018年12月份以“Molecular characteristics of early-stage female germ cells revealed by RNA sequencing of low-input cells and analysis of genome-wide DNA methylation”為題發(fā)表于權(quán)威期刊DNA Research，文章引用了烈冰自主研發(fā)的可變剪接算法ASD（Alternative Splicing Detector，網(wǎng)址：http://www.halifax-nova-scotia-real-estate.com/asd/ASD.html）烈冰技術(shù)團(tuán)隊(duì)也在其中提供了大量的數(shù)據(jù)分析服務(wù)和技術(shù)支持。

背景

在大多數(shù)多細(xì)胞生物中，包括哺乳動物，生殖細(xì)胞是一個新個體的起源，因此也承擔(dān)著將遺傳信息從上一代傳遞到下一代的職責(zé)。原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells，PGCs）是在發(fā)育初期階段建立的第一個生殖細(xì)胞群[1]。PGCs在經(jīng)歷過遷移和性別分化之后，具有XX基因型的雌性胚胎PGC進(jìn)入減數(shù)分裂的細(xì)胞前期I，然后在雙線期階段停滯，成為生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）卵母細(xì)胞。在激素刺激下，GV卵母細(xì)胞完成第一次減數(shù)分裂，發(fā)育成為細(xì)胞中期II（MII）卵母細(xì)胞,又稱次級卵母細(xì)胞。

然而，最近的研究表明并非所有PGC都進(jìn)入上述的分化途徑[2-4]。研究報道，通過免疫磁性分選可以從5日齡和成年小鼠的卵巢中分離出雌性生殖系干細(xì)胞（female germline stem cell，FGSC）。在培養(yǎng)超過15個月后，F(xiàn)GSC仍然表現(xiàn)出增殖能力和正常核型，并且可以繁殖出可育后代[5]。另外，在產(chǎn)后的大鼠，豬和成年女性的卵巢中也證實(shí)了FGSCs的存在[6-8]。

該文章中，研究者使用RNA測序（RNA-seq）技術(shù)，對新鮮分離的FGSC的轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并破解PGC，F(xiàn)GSC，GV和MII卵母細(xì)胞中基因表達(dá)的時空模式。這些研究對于更深入地了解雌性生殖細(xì)胞的發(fā)育過程和FGSC的分子特征至關(guān)重要。

文章思路:

1.分別對PGC，F(xiàn)GSC，GV和MII卵母細(xì)胞進(jìn)行微量細(xì)胞的RNA-seq，獲得表達(dá)譜數(shù)據(jù)；

2.通過對不同發(fā)育階段的甲基化水平檢測，對表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證；

3.鑒定出與FGSC分化相關(guān)的關(guān)鍵pathway；

4.對不同發(fā)育階段的基因表達(dá)進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，鑒定出核心基因；

5.對不同階段的lncRNA表達(dá)進(jìn)行動態(tài)分析，鑒定出核心lncRNA；

6.對不同階段的可變剪接模式進(jìn)行分析，探索潛在分子機(jī)制。

結(jié)果展示:

1. 雌性生殖細(xì)胞在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄譜分析

研究者分別對PGC，F(xiàn)GSCs，GV和MII卵母細(xì)胞進(jìn)行了5-8個細(xì)胞的RNA-seq，以檢測不同階段雌性生殖細(xì)胞中基因的表達(dá)情況，最終在37,980個已知小鼠基因中檢測到平均17,805（47％）個基因的表達(dá)。特別是在FGSCs中，基因表達(dá)比例達(dá)到49％。為了探究這些基因表達(dá)譜是否與發(fā)育階段相關(guān)，研究者使用非監(jiān)督層次聚類算法來對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，這些雌性生殖細(xì)胞準(zhǔn)確地符合發(fā)育順序，從PGC到FGSC，并且如所預(yù)期的那樣以GV和MII卵母細(xì)胞結(jié)束（圖1A）。主成分分析（PCA）的結(jié)果揭示了發(fā)育階段之間表達(dá)模式的差異（圖1B））。所有階段的基因表達(dá)的成對比較的結(jié)果也證明了階段特異性的基因表達(dá)模式（圖1C）。有趣的是，大多數(shù)差異表達(dá)基因（DEGs）可以聚集成反映階段特異性表達(dá)模式的四個不同階段，因此可能在雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖1D）。

圖1.不同階段細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜分析

2. 雌性生殖細(xì)胞在發(fā)育過程中的全基因組甲基化模式分析

為了進(jìn)行雌性生殖細(xì)胞發(fā)育的全基因組DNA甲基化分析，研究者首先對新鮮分離的FGSC進(jìn)行MeDIP-Seq，并分析了PGC， GV卵母細(xì)胞和MII卵母細(xì)胞的全基因組DNA甲基化的最新數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，PGC具有相對較低的甲基化水平。性別分化后，FGSC也維持較低的甲基化，同時增加甲基化并分化成GV和MII卵母細(xì)胞（圖2A），這與RNA-seq得到的基因表達(dá)數(shù)據(jù)形成呼應(yīng)。為了明確新鮮分離的FGSCs與培養(yǎng)的FGSCs之間是否存在表觀遺傳模式改變，研究者對這兩個群體進(jìn)行了全基因組DNA甲基化分析，可以觀察到二者之間顯示出非常相似的DNA甲基化模式（圖2B），并由染色體標(biāo)度和Stra8基因座證實(shí)（圖2C）。接下來，研究者分析了新鮮和培養(yǎng)的FGSC基因組中CpG島（CGIs）的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的FGSCs中超過95％的甲基化CGIs可在新鮮的FGSC中被重新捕獲（圖2D））。對共享的甲基化CGI進(jìn)行了功能注釋，發(fā)現(xiàn)富集功能主要與體細(xì)胞發(fā)育有關(guān)（圖2E）?？傊?，這些觀察結(jié)果表明培養(yǎng)的FGSC的DNA甲基化模式幾乎與新鮮FGSC的DNA甲基化模式相同。

圖2.不同發(fā)育階段細(xì)胞的甲基化模式分析

3.雌性生殖細(xì)胞DEGs的pathway分析

為了探索雌性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中涉及的生物過程相關(guān)pathway，研究者使用基于貝葉斯模型的聚類方法來分析從PGC到MII卵母細(xì)胞的DEGs，確定了13種重要的模型表達(dá)趨勢（圖3A），其中趨勢1和10表現(xiàn)出從PGCs到MII卵母細(xì)胞的逐漸下降趨勢，因此推斷其與FGSCs的自我更新有關(guān)。相反，趨勢8和24表現(xiàn)出從FGSC到GV卵母細(xì)胞的增加趨勢，表明這兩組與FGSC分化有關(guān)。有趣的是，趨勢1/10共享一個途徑PI3K-AKT（圖3B I），而趨勢8/24共享TGF-β途徑（圖3B II），提示這兩種途徑分別在維持自我更新和調(diào)節(jié)FGSCs分化中起著關(guān)鍵作用。 為了證實(shí)PI3K-AKT信號通路在FGSC自我更新和存活中的作用，研究者通過AKT抑制劑IV和染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)AKT抑制劑IV處理的FGSC中凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞的比例增加（圖3C）。對于TGF-β途徑，先前的研究將BMP4鑒定為PGC分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[32],表明TGF-β超家族可能在小鼠卵子形成過程中調(diào)節(jié)FGSC分化，該發(fā)現(xiàn)與通路分析的結(jié)果相匹配，進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA-seq數(shù)據(jù)。

圖3. 雌性生殖細(xì)胞DEGs的pathway分析

4. 雌性生殖系發(fā)育的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為了研究雌性生殖細(xì)胞發(fā)育階段與特定基因調(diào)控模塊之間的共表達(dá)關(guān)系，研究者進(jìn)行了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），發(fā)現(xiàn)雌性生殖系發(fā)育涉及25個共表達(dá)模塊（圖4A））。在類似功能模塊合并后，獲得了四個復(fù)合模塊，這些模塊顯示了階段特異性的表達(dá)模式。GO富集顯示這些模塊涉及一些階段特異性生物過程，如RNA加工，細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期（PGCs），有絲分裂細(xì)胞周期和核分裂（FGSCs），配子生成和有性生殖（GV卵母細(xì)胞），減數(shù)分裂染色體分離和程序性細(xì)胞死亡（MII卵母細(xì)胞）（圖4B）。然后研究者檢測了發(fā)育期間模塊表達(dá)的分布，發(fā)現(xiàn)PGC模塊在發(fā)育過程中逐漸降解，而從FGSC到GV卵母細(xì)胞或從GV到MII卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)變中的模塊顯示出急劇退化和持續(xù)激活（圖4C）。

研究者分析了模塊和發(fā)育階段之間的相關(guān)性（圖4D），證明小鼠雌性生殖系發(fā)育也涉及階段特異性共表達(dá)模塊。接下來，為了鑒定核心階段特異性調(diào)控基因，研究者構(gòu)建了核心基因網(wǎng)絡(luò)，并篩選出一組核心基因：Ncapd2，INCENP，Rab5b，PSAP，GTPBP3和EIF4H（圖4E）。通過這些分析，研究者推測FGSCs可能與這些核心基因有關(guān)，并通過控制其有絲分裂進(jìn)程進(jìn)一步指導(dǎo)干細(xì)胞自我更新。

圖4. 雌性生殖系發(fā)育的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

5.lncRNA的動態(tài)表達(dá)分析

為了追蹤雌性生殖系發(fā)育中長非編碼RNA（lncRNA）的表達(dá)，研究者鑒定出632個顯著差異表達(dá)的lncRNA。經(jīng)過層次聚類分析，研究者發(fā)現(xiàn)，與蛋白質(zhì)編碼基因一樣，這些lncRNAs顯示出非常獨(dú)特的階段特異性表達(dá)模式，表明它們在雌性種系發(fā)育過程中具有調(diào)節(jié)作用（圖5A）。

miRNA是哺乳動物發(fā)育和體內(nèi)平衡的重要調(diào)節(jié)劑，lncRNA通過與miRNA的結(jié)合調(diào)節(jié)其相應(yīng)的mRNA。本研究中，研究者使用了三個核心基因（Ncapd2，CDKN1A和Rab5b），兩個已知的生殖系標(biāo)記基因（MVH和C-KIT）和一個干細(xì)胞相關(guān)基因（LHX1）構(gòu)建交互網(wǎng)絡(luò)，獲得了功能特征性的lncRNA，包括XIST和MALAT1（圖5B，C）。使用單細(xì)胞RT-PCR，研究者在FGSC階段鑒定到XIST的表達(dá)（圖6D），這與RNA-Seq數(shù)據(jù)一致。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)ZFP783可通過miR-6963-3p與FGSCs中的MVH和CDKN1A相互作用。由于CDKN1A已被證實(shí)對維持FGSCs很重要（圖3C XII），因此揭示了ZFP783可通過miRNA海綿效應(yīng)來對FGSC分化和有絲分裂細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

圖5. lncRNA的動態(tài)表達(dá)分析

6.可變剪接的動態(tài)模式分析

在雌性生殖系發(fā)育過程中，研究者發(fā)現(xiàn)FGSCs的可變剪接（AS）發(fā)生頻率最高（圖6A），可能有助于FGSCs的自我更新和分化。在FGSC階段具有兩個或更多個轉(zhuǎn)錄物的已知基因的比例也顯示在圖6B中。

為了進(jìn)一步研究FGSC特異性AS模式，研究者獲得PGC與FGSC和FGSC與GV卵母細(xì)胞之間的AS的交叉元件用于后續(xù)分析。通過調(diào)整P值<0.05，研究者在FGSC階段鑒定了698個AS事件（圖6C），其中內(nèi)含子保留和盒式外顯子都是關(guān)鍵的AS模式。有趣的是，G蛋白偶聯(lián)受體途徑也參與到有絲分裂過程（圖6D）。根據(jù)以往的研究，研究者繪制出幾個核心基因（DTYMK，F(xiàn)HL1，CDK2，SYCP3和TBP）的AS類型（圖6E）。綜合這些結(jié)果，研究者推測動態(tài)AS模式可以影響有絲分裂相關(guān)的基因表達(dá)，繼而促進(jìn)FGSC的特性形成。

圖6.可變剪接的動態(tài)模式分析

綜上，本研究系統(tǒng)地分析了PGCs，F(xiàn)GSCs，GV和MII卵母細(xì)胞的形態(tài)和分子特征。通過RNA-Seq對已知的RefSeq基因，已知的lncRNA，新的lncRNA和AS的動態(tài)模式進(jìn)行研究，描繪出雌性生殖系發(fā)育和FGSC來源的卵母細(xì)胞形成背后的發(fā)育階段特異性和調(diào)節(jié)機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)對于研究卵細(xì)胞發(fā)育過程中的分子pathway和機(jī)制非常寶貴，并將在其他類型干細(xì)胞研究中得到更廣泛應(yīng)用。

烈冰會繼續(xù)在自己擅長的生物信息分析領(lǐng)域深耕細(xì)作，推出更多更高質(zhì)的產(chǎn)品和生信分析工具，憑借實(shí)力助力廣大科研工作者的科學(xué)研究。想了解更多信息，請聯(lián)系您的區(qū)域業(yè)務(wù)經(jīng)理進(jìn)行咨詢~

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