分析思路：

檢測樣本信息：

PBMC，腦組織，腦脊液

檢測平臺：

質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)，免疫組織化學(xué)，Plate-seq，Drop-seq（10X Genomics）

研究結(jié)果：

1. AD患者外周血CD8⁺ T_EMRA細(xì)胞增多且與認(rèn)知能力呈負(fù)相關(guān)

研究者通過多個隊列分析來評估AD的適應(yīng)性免疫（圖1a），使用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)研究了AD患者和前驅(qū)輕度認(rèn)知障礙（MCI）患者的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）。然后使用聚類計算方法(spanning-tree progression analysis of density-normalized events，SPADE)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)患有MCI或AD的患者存在細(xì)胞數(shù)顯著增多的CD8⁺群體（圖1b），即cluster 63。該細(xì)胞群體的標(biāo)志物與CD3⁺CD8⁺CD27^- T效應(yīng)記憶CD45RA⁺（T_EMRA）細(xì)胞標(biāo)志物相一致（圖1d），是一種能夠分泌促炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性分子的具有效應(yīng)性功能的細(xì)胞群體。

為了進(jìn)一步研究CD8⁺ T細(xì)胞在MCI和AD中的作用，研究者在Cohort 2（圖1a）中評估了認(rèn)知與記憶T細(xì)胞種群之間的關(guān)系。揭示了在MCI和AD中，CD8⁺ TEMRA細(xì)胞與認(rèn)知能力呈負(fù)相關(guān)（圖1e）。使用PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)刺激PBMC后，來自MCI或AD患者的CD8⁺ T細(xì)胞的IFN-γ水平明顯高于對照CD8⁺ T細(xì)胞（圖1f），即MCI或AD患者的外周CD8⁺ T細(xì)胞相較于正常人存在一定的功能差異。然后對CD8⁺ TEMRA細(xì)胞進(jìn)行drop-seq單細(xì)胞測序且通過差異表達(dá)和通路分析發(fā)現(xiàn)，MCI和AD患者中CD8⁺TEMRA細(xì)胞的氨基酸代謝顯著減少，TCR和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)增加（圖1g，h）。

以上結(jié)果表明，與對照組相比，MCI和AD患者的外周CD8⁺ TEMRA細(xì)胞具有更大的抗原刺激性。

圖1 MCI/AD患者中發(fā)現(xiàn)的TEMRA細(xì)胞受到抗原刺激性更大

2. CD8⁺ T細(xì)胞進(jìn)入AD患者的大腦

接下來研究者為了確定AD患者的大腦中是否存在CD8⁺ T細(xì)胞，對Cohort 3（圖1a）中正常人和AD患者的大腦進(jìn)行CD8和Aβ免疫組化實驗，以及CD8⁺ T細(xì)胞與大腦血管接近程度的分析。發(fā)現(xiàn)在三個AD大腦海馬區(qū)，伴有腦淀粉樣血管病變的血管周隙中存在大量血管外CD8⁺ T細(xì)胞（圖2a），受AD影響的海馬中CD3⁺CD8⁺ T細(xì)胞明顯多于對照海馬（圖2b），且CD8⁺ T細(xì)胞與微管相關(guān)蛋白2 (MAP2)⁺神經(jīng)元具有一定的相關(guān)性（圖2c）。最后研究者從AD患者的大腦海馬附近的軟腦膜中也檢測到了CD3⁺CD8⁺ T細(xì)胞（圖2d）。

以上研究結(jié)果表明，在AD患者的大腦中檢測到了CD8⁺ T細(xì)胞的存在。

圖2 AD患者大腦中檢測到CD8⁺ T細(xì)胞

3. AD患者腦脊液中CD8⁺ TEMRA細(xì)胞的克隆擴(kuò)增

CD8⁺ T細(xì)胞在腦軟腦膜的定位促使研究者想要繼續(xù)探索抗原特異性細(xì)胞是否也在CSF中存在。研究者發(fā)現(xiàn)健康老年受試者的CSF中的免疫細(xì)胞主要包含T細(xì)胞，以及少量的先天免疫細(xì)胞和微量的B細(xì)胞，其中CD8⁺ T細(xì)胞群幾乎完全由效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（T effector memory，T_EM）細(xì)胞組成，TEMRA細(xì)胞約占該T_EM群的20％。

在接下來的研究中，研究者使用plate-seq和drop-seq兩種測序方法進(jìn)行T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增評估，患者數(shù)據(jù)均來源于Cohort 4（圖1a）。發(fā)現(xiàn)在CSF的T細(xì)胞中主要是CD8⁺T細(xì)胞發(fā)生克隆擴(kuò)增，其中一位AD患者的存在大量擴(kuò)增的克隆，占CD8⁺ T細(xì)胞的44％（圖3b）。隨后Marker基因鑒定發(fā)現(xiàn)該克隆為CD8⁺ CD45RA ⁺ CD27^- TEMRA細(xì)胞（圖3c）。這項發(fā)現(xiàn)首次提出了受年齡相關(guān)神經(jīng)退行性病變影響的大腦腦脊液中存在克隆擴(kuò)增的CD8⁺ T細(xì)胞。

研究者使用drop-seq對CSF細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分群時同樣發(fā)現(xiàn)大多數(shù)CSF細(xì)胞是T細(xì)胞（圖3d,e）。然后對這些細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞TCR測序（scTCR-seq），發(fā)現(xiàn)來自MCI或AD患者的CSF細(xì)胞中有許多高度擴(kuò)增的CD8⁺克隆，而對照組則相反（圖3f,g,h）。通過差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)MCI和AD中高度擴(kuò)增的克?。淳哂形鍌€以上相同TCRαβ序列的T細(xì)胞）表現(xiàn)出細(xì)胞毒性效應(yīng)基因的表達(dá)增加（圖3i）。通過占比分析發(fā)現(xiàn)49.13％的克隆擴(kuò)增細(xì)胞是CD8⁺ TEMRA細(xì)胞（圖3j），且MCI和AD中的這類細(xì)胞同樣表現(xiàn)為細(xì)胞毒性效應(yīng)基因表達(dá)的增加。尤其在MCI和AD病患中高表達(dá)影響認(rèn)知的衰老因子人類白細(xì)胞抗原C（HLA-C）和β-2-微球蛋白（B2M）以及其他與AD相關(guān)的基因。（圖3k）。研究者還發(fā)現(xiàn)CD8⁺ T細(xì)胞中GZMA基因的表達(dá)（圖3l）以及AD患者海馬中GZMA⁺CD8⁺細(xì)胞具有更高的百分比（圖3m）。

以上結(jié)果揭示了AD患者的CSF中CD8⁺ TEMRA克隆細(xì)胞的促炎和細(xì)胞毒性功能。

圖3 AD患者的CSF中CD8⁺ TEMRA細(xì)胞發(fā)生克隆擴(kuò)增且具有促炎功能

4.AD患者腦脊液中克隆擴(kuò)增TCRs的抗原鑒定

接下來，研究者希望確定是何種抗原引起了CD8⁺ TEMRA細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。通過構(gòu)建TCRαβ序列的未加權(quán)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)一例MCI和一例AD患者間具有一個共享的克隆，而另一例AD患者共享了其中的TCRβ序列，這條TCRβ序列（CASSLGQAYEQYF）對一種皰疹病毒EBV的EBNA3A抗原（Herpesviridae Epstein–Barr nuclear antigen 3）具有特異性（圖4b），并在該克隆中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性效應(yīng)基因表達(dá)增加（圖4c）。隨后研究者使用GLIPH算法對未知的TCR序列進(jìn)行特異性抗原的確定。發(fā)現(xiàn)AD患者共享的TCRβ鏈（CASSLAGGYNEQFF）與第三位AD患者的TCRβ鏈（CASSLGTGNNEQFF）具有同源性（圖4d）。

通過構(gòu)建表達(dá)TCRαβ1和TCRαβ2細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)TCRαβ1細(xì)胞對MHC-1肽庫有反應(yīng)，而TCRαβ2細(xì)胞無反應(yīng)（圖4e）。然后將TCRαβ2作為對照，發(fā)現(xiàn)只有一個肽段激活了TCRαβ1細(xì)胞，即來源于EB病毒反式激活蛋白BZLF1的7-RAKFKQLL（圖4f,g）。

以上，研究者通過對TCR的測序及分析發(fā)現(xiàn)了AD中一種新型的TCR，對EBV反式激活蛋白BZLF1具有特異性。

圖4 AD患者CSF細(xì)胞中TCR的抗原鑒定

綜上所述，研究者通過對TCR序列的分析證明了AD中CD8⁺ T細(xì)胞的抗原特異性克隆的擴(kuò)增，并鑒定出EBV抗原的特異性TCR，雖然還不足以說明EBV感染與AD之間有明確的因果關(guān)系，但通過分析TCR，鑒定克隆以及通過TCR識別抗原的方法將會為研究神經(jīng)退行性疾病的適應(yīng)性免疫提供新的途徑。

原文鏈接：http://nature.webvpn.ustc.edu.cn/articles/s41586-019-1895-7

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