CRISRP/Cas9是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的基因編輯技術，利用這項技術，研究者可以根據(jù)需求對特定染色體位點進行高效的改造。然而該技術也受到了脫靶效應的困擾。ChIP-seq是用于在全基因組范圍中研究DNA結合蛋白、組蛋白修飾和核小體的技術，常用于表觀遺傳學方面的研究。在今天向大家介紹的文章中，作者將CIRSPR/Cas9技術和ChIP-seq技術相結合，首次在奶牛中定點插入了結核病抗性基因，獲得了正確插入該基因的能夠抵抗牛結核病的奶牛，并且在這些奶牛中沒有檢測到脫靶效應。

 

研究背景 
      同源重組（HDR）是一種針對染色體特定位點進行編輯的有效手段，在以往的研究中常會利用鋅指核酸酶或者TALEN技術來引起DNA雙鏈的斷裂，然后根據(jù)提供的模板序列進行同源重組修復，從而達到對染色體的定點改造。近年來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)使基因編輯變得更為簡便，這也使得該技術被迅速應用在科研、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學等多個領域。 
      CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用Cas9蛋白中的兩個核酸酶活性位點分別對DNA的雙鏈進行切割，引起DNA雙鏈的斷裂，然而在DNA斷裂處的修復過程中，除了根據(jù)提供的模板進行同源重組修復之外，還有另外一種修復機制也同樣存在，即非同源末端連接（NHEJ）。在這個過程中，會引起DNA斷裂處發(fā)生小片段的插入或缺失（indel），從而造成不可預知的后果。同時，近年來的研究也發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)還會引發(fā)脫靶效應。這些潛在的弊端會對基因的定點改造，特別是在基因治療以及轉基因動物的繁育中帶來一定的安全問題。 
      目前在這方面已經(jīng)開展了一系列工作，希望能夠提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率、位點識別的特異性以及發(fā)掘更多功能上的延展。不過在哺乳動物中進行較大功能性基因插入的研究工作還比較有限。

近日，來自中國西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院的張涌教授團隊利用CRISPR/Cas9技術，首先在奶?；蚪M中分析得到了潛在的適用于基因定點編輯的位點，然后結合ChIP-seq，靶向PCR測序等多種實驗技術，得到了針對這些位點的結合效率以及潛在的脫靶位點，并對DNA編輯效率進行了評價。其中烈冰科技在ChIP-seq的測序實驗及數(shù)據(jù)分析過程中提供了有力的支持，通過基因組層面的分析，得到了靶向位點的相關重要信息。 
接著張教授團隊通過單個核酸酶失活的Cas9蛋白（Cas9 nickase，Cas9n）結合選定的編輯位點，造成了DNA單鏈的斷裂，并介導了同源重組修復，在奶?；蚪M中定點插入了一個結核病相關的抗性基因，得到了具有抵抗牛結核病能力的奶牛，同時針對ChIP-seq分析得到的脫靶位點進行檢測后沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應的產(chǎn)生。 
該研究結果以”Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced off-target effects”為題發(fā)表于著名學術期刊Genome Biology。

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研究思路 
     首先我們來理清這項研究思路，如下圖所示。

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研究結果 
      1、作者選取25號染色體上FSCN1以及ACTB兩個管家基因的基因間區(qū)作為潛在的基因插入位點，從而理論上可以有效避免因染色質失活而引起的基因表達沉默。通過在線分析工具ZiFiT，找到了80個靶位點，并根據(jù)off-target預測工具Cas-OFFinder以及錯配堿基的位置最終選取了14個靶位點，設計sgRNA后用于后續(xù)檢測。在確定了合適濃度后，作者在牛胎兒成纖維細胞中利用錯配內切酶檢測法得到了針對這14個位點的切割效率。

2、接下來作者想進一步分析這些位點結合的特異性以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應的程度。作者利用dCas9，選取2、20、22、45號4個位點，通過ChIP-seq的方式進行檢測。分析結果顯示在每一個sgRNA對應的位點上都發(fā)現(xiàn)了較強的peak，同時也得到了該sgRNA/dCas9在其他位點上的結合，這些區(qū)域中潛在的位點都有可能是在實際基因編輯過程中的脫靶位點。通過計算分析得到每個結合區(qū)域潛在的20bp識別序列后，對該序列堿基組成進行了分析，發(fā)現(xiàn)PAM序列附近的堿基較PAM序列遠端的堿基具有更高的保守性。

3、根據(jù)ChIP-seq的結果，作者計算了peak的富集度，并且列舉了每一個sgRNA對應的15個富集度最高的off-target位點以及堿基匹配信息。

4、隨后，作者通過WT Cas9和Cas9n蛋白配合4種sgRNA進行了細胞實驗，并且利用PCR擴增了每個sgRNA經(jīng)ChIP-seq分析得到的on-target區(qū)域和15個off-target區(qū)域，進行高通量測序，去分析DNA的切割效率。結果發(fā)現(xiàn)在WT Cas9蛋白的結果中，on-target位點發(fā)生indel的概率非常高，同時也有數(shù)個off-target位點indel水平也要顯著高于對照組。而單個Cas9n的indel概率和對照組基本一致，低于WT Cas9，暗示單個Cas9n介導的單鏈斷裂可以從一定程度上避免NHEJ修復機制的發(fā)生。

5、接著，作者希望進一步去評價Cas9n介導的同源重組效率。作者選取了20、45號位點以及2+19、16+34號位點組合共4組用于后續(xù)實驗，并以此設計了兩個用于同源重組修復的質粒。將WT Cas9、Cas9n連同sgRNA轉染細胞后，檢測了DNA的重組效率。結果顯示與WT Cas9相比，所有單個Cas9n介導的同源重組效率都相對較低。而在20和45號位點，單個Cas9n與配對Cas9n的效率相似，這暗示著單個Cas9n介導的單鏈斷裂也可以引起同源重組的發(fā)生。

6、在完成了前期的可行性實驗后，作者選取了一個牛結核病相關的抗性基因NRAMP1，并試圖將該基因插入奶牛基因組的特定位點中。作者還是利用WT Cas9、Cas9n并結合4種位點組合方式（20、45、2+19以及16+34），將質粒轉染入牛胎兒成纖維細胞中。經(jīng)嘌呤霉素篩選陽性克隆后，采用PCR以及southern blot的方式來鑒定同源重組是否正確發(fā)生。

7、接著，作者對篩選到的細胞進行了核型分析、細胞形態(tài)學分析，生長速率分析等多種指標評價，在45號位點得到了113個雜合的克?。ǚ謩e為WT Cas9 50個和Cas9n 63個），這些細胞可用于體細胞核移植。作者隨機各挑選了4個克隆進行體細胞核移植，分別得到了2385和2434個重組胚胎，其中又分別有525和753個胚胎成功發(fā)育到了囊胚期，作者將其接入了173只以及248只母牛的輸卵管中。最終共有20只（Cas9n組16只）小牛出生并且有11只（Cas9n組9只）存活了超過3個月。作者再次通過PCR以及southern bolt鑒定了11只小牛的重組情況，并確認NRAMP1準確插入了45號位點。

8、與此同時，作者對15個ChIP-seq分析得到的off-target位點進行了檢測，結果在WT Cas9組中發(fā)現(xiàn)了3個位點存在indel，而在Cas9n組的9只牛中沒有發(fā)現(xiàn)任何的indel事件。

9、最后，作者檢測了45號插入位點鄰近基因的表達，并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異。同時也檢測了NRAMP1在體內的表達分布情況。然后作者通過體外以及體內實驗證明了轉基因奶牛確實能夠增強對牛分枝桿菌的抵抗能力。

通過上述實驗及分析，作者首次將單個Cas9n技術運用到家畜中，并成功獲得了抗牛結核病的奶牛。后續(xù)檢測中沒有在這些奶牛 中發(fā)現(xiàn)脫靶效應的產(chǎn)生，使得這個位點成為了在牛基因組中一個有用的位點，利用基因編輯技術靶向這個位點可以插入其他有益于家畜的新基因。同時也暗示著這項技術可以作為一種潛在的更安全的方法來進行基因編輯，為轉基因家畜的培育提供了新的手段。