一本到高清DVD91日韩伦理影院|无码AV中文一区国产强奸三级簧片|日韩无码色哟哟午夜福利国产一区|丁香激情五月亚洲亚洲影院123区|五月天综合久久国产精品free|亚洲免费专区日韩热在线视频|黄片看视频免费久久偷拍的视频|五月婷桃色网日韩国产一级

服務(wù)熱線02152235399
當(dāng)前位置:博客 > 單細(xì)胞

ScATAC-seq——原理及實(shí)驗(yàn)流程大起底

時(shí)間:2020-06-19    |    閱讀量:18437

烈冰生物單細(xì)胞測(cè)序產(chǎn)品另一“虎將”——ScATAC-seq一經(jīng)上線就迅速走紅,引起不小的轟動(dòng)!很多老師也對(duì)單細(xì)胞ATAC測(cè)序產(chǎn)生了極大的興趣。本期,小編就帶大家一起來(lái)詳細(xì)了解一下ScATAC-seq測(cè)序的原理和實(shí)驗(yàn)流程介紹。


ScATAC-seq作為ATAC-seq的進(jìn)階版,能夠區(qū)分實(shí)驗(yàn)樣本的細(xì)胞類(lèi)型,細(xì)胞分化過(guò)程開(kāi)放性染色質(zhì)有什么差異,調(diào)控了哪些信號(hào)通路等等。總的來(lái)說(shuō),ScATAC-seq能在基因組水平上幫助我們了解細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程,揭示不同調(diào)控因子位點(diǎn),從表觀遺傳學(xué)的角度來(lái)解析基因信息。ScATAC-seq在開(kāi)放染色質(zhì)圖譜繪制,細(xì)胞分化發(fā)育,疾病的致病機(jī)制,腫瘤微環(huán)境、生物標(biāo)志物等方面具有極大的應(yīng)用前景。

要了解ScATAC-seq,首先我們要知道什么是ATAC-seq。ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing)是利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可及性的高通量測(cè)序技術(shù),通俗來(lái)說(shuō)就是基于染色質(zhì)可及性的特點(diǎn),將攜帶測(cè)序信息的Tn5轉(zhuǎn)座酶插入染色質(zhì)中,由于轉(zhuǎn)座酶只能剪切染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域并標(biāo)記DNA序列,再進(jìn)行高通量測(cè)序就能獲得相關(guān)基因信息。



正常情況下,DNA與核小體纏繞折疊在一起形成染色質(zhì),但是DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄都需要將染色體的高級(jí)結(jié)構(gòu)解開(kāi),然而解壓并不需要打開(kāi)全部染色體,只需要打開(kāi)表達(dá)基因的區(qū)域,這部分打開(kāi)的染色質(zhì),就叫開(kāi)放染色質(zhì)(open chromatin)。打開(kāi)染色質(zhì),允許部分調(diào)控蛋白(比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子)與之相結(jié)合的特性,即染色質(zhì)的可及性(chromatin accessibility)。



對(duì)染色質(zhì)可及性探究的方法有很多,比如DNase-seq,MNase-seq,ChIP-seq,F(xiàn)AIRE-seq等。DNase-seq和MNase-seq方法利用限制性酶對(duì)染色質(zhì)DNA進(jìn)行片段化處理,該方法不能獲得完整開(kāi)放的染色質(zhì)信息。相較于粗暴的核酸酶,ScATAC-seq利用的Tn5轉(zhuǎn)座酶沒(méi)有偏好性,它能夠完整地將整個(gè)開(kāi)放區(qū)域的序列直接捕獲下來(lái),所需的細(xì)胞數(shù)量少(最少500個(gè)起始細(xì)胞),能夠在短時(shí)間內(nèi)使用微量樣本獲得大量有效信息,且靈敏度高、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。


ATAC-seq是把所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞看作了一個(gè)整體,獲得所有細(xì)胞混合的基因信息。ScATAC-seq是在ATAC-seq的基礎(chǔ)上,進(jìn)行細(xì)胞核的分選和標(biāo)記,通過(guò)barcode識(shí)別細(xì)胞核,解決了不同細(xì)胞群體的異質(zhì)性的問(wèn)題,能夠檢測(cè)出混雜樣品測(cè)序所無(wú)法得到的異質(zhì)性信息。


●●● ScATAC-seq 細(xì)胞核的捕獲和標(biāo)記 ●●●

上面我們介紹了轉(zhuǎn)座酶是如何切割開(kāi)放性染色質(zhì)的。相較于ATAC-seq,ScATAC-seq在細(xì)胞核的捕獲和標(biāo)記方面,烈冰用10×Geomics ChromiumTM系統(tǒng)引入帶有特定barcode標(biāo)簽的凝膠磁珠(beads)來(lái)標(biāo)記細(xì)胞核。橫向孔道中輸入beads,第一列輸入細(xì)胞核,細(xì)胞核和beads吸附結(jié)合后在微流控作用下向右移動(dòng),進(jìn)入第二列輸入的油滴中,形成油包水的結(jié)構(gòu)。這時(shí)候,一個(gè)液滴=一個(gè)beads=一個(gè)細(xì)胞核=一個(gè)ATAC-seq,對(duì)酶切后的短片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。最后去除油滴,所有的序列混合在一起,進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

總的來(lái)說(shuō),ScATAC-Seq實(shí)驗(yàn)包括以下幾個(gè)部分:制備單細(xì)胞懸液→細(xì)胞破碎提核→單細(xì)胞核分選→文庫(kù)構(gòu)建→上機(jī)測(cè)序。具體實(shí)驗(yàn)流程如下: